DB15_T 2833-2022 狼源性成分检测 实时荧光PCR法.docxVIP

ICS67.120.01CCSB45

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2833—2022

狼源性成分检测实时荧光PCR法

Real-timePCRmethodfordetectionofcanislupus-derivedmaterials

2022-12-08发布2023-01-08实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2833—2022

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国二连海关。

本文件主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、荆文魁、苏日娜、张志峰、常鸿、寇福军、赵治国。

DB15/T2833—2022

1

狼源性成分检测实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中狼源性成分的鉴定，灵敏度为0.15ng/μL。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRreal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。

3.2

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide)

DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)

FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)

PCR:聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

5试剂与材料

DB15/T2833—2022

2

5.1水：符合GB/T6682的要求。

5.2引物对序列:

a)上游：5′-CCGTACTCTAGCTTACATA-3′；

b)下游：5′-GAGACCTTCCAGATGAAA-3′；

c)探针序列：5′-(FAM)-TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3′。

5.3DNA提取试剂盒。

5.4CTAB。

5.5Tris-HCl(pH8.0)。

5.6NaCl。

5.7EDTA。

5.8蛋白酶K溶液(20mg/mL)。

5.9三氯甲烷。

5.10异丙醇。

5.1175%乙醇。

5.12实时荧光PCR预混液。

5.13阳性对照样品：采用已知含有狼源性成分样品的DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录B。

5.14阴性对照样品：采用已知不含有狼（包括其他犬科动物）源性成分样品的DNA。

5.15空白对照：ddH2O。

6仪器与设备

6.1实时荧光PCR仪（加热速率10℃/s以上）。

6.2高速台式离心机（最高转速12000rpm）。

6.3旋涡振荡器（最高转速3000rpm）。

6.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.5恒温水浴锅。

6.6天平（感量0.01g）。

6.7单孔道微量移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。

7实验方法

7.1DNA提取

参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值