原核表达宿主菌株选择指南.pdf

在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表

达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、

表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。事实上,在

平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择――

多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或

者是载体配套的菌株,而不去追究原因――即使表达结

果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究

菌株的选择是否适合。

作为原核表达的宿主,对外源基因的表达会产生一定的影响,是勿庸置疑的。

每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂,按照细胞固有的程序完成“你给它们安排

的生产任务”――因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的,当出现问题时,

我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?

知其然还要知其所以然。比如,菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达

产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经

典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。

大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因

的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表

达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta2系列就是更好的

选择――这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的七种

(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA,提高外源基因、尤其

是真核基因在原核系统中的表达水平。(已经携带有氯霉素抗性质粒)

当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K-12衍生

菌Origami2系列,thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase

(gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白

可溶性及活性表达。(卡那霉素敏感)

Rosetta-gami?2则是综合上述两类菌株的优点,既补充7种稀有密码子,又

能够促进二硫键的形成,帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。

(卡那霉素敏感)

OrigamiB是衍生自lacZY突变的BL21菌株,这个突变能根据IPTG的浓度精

确调节表达产物,使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。(四环素敏感)

在决定试用这些名字古怪的菌株时,有几个小Tips要注意的,一个是不同菌株

有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性,要注意自己的表达质粒是否

能与之兼容。比如Rosetta2已经携带有氯霉素抗性质粒,不能再用氯霉素筛选等

等。

现象

可能原因

改进方案

建议菌株

无蛋白表达出现截短蛋白

E.coli的密码子偏移性

补充稀有密码子的tRNA;将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子Rosetta2

Rosetta-gami2

Rosetta-gamiB

RosettaBlue

包涵

二硫键形成困难

降低宿主胞质的还原性;利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami2

Rosetta-gami2

Rosetta-gamiB

表达过快,表达量过高

控制优化表达水平:降温,IPTG浓度优化

Tuner

Rosetta-gamiB

蛋白无活性

蛋白错误折叠

降低宿主胞质的还原性;利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami2

Rosetta-gami2

Rosetta-gamiB

控制优化表达水平:降温,IPTG浓度优化

Tuner

Rosetta-gamiB

细胞死亡,生长极困难

毒性蛋白

更严格的本底表达控制

pLysS菌株

无克隆生长

过高本底表达

更严格的本底表达控制

pLysS、pLysE菌株

重组质粒和菌株的保存建议

在实验室里保存重组菌株的时候,为了挑菌和传代方便,我们常用LB平板保存

在4℃冰箱中,需要提质粒和表达接种的时候,就直接从平板上挑菌,但是这种方法