《生物样本中抗生素耐药菌的快速检测方法-拉曼光谱法》.docxVIP

GB/TXXXXX—XXXX

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CCSX04

ICS07.100

团体标准

T/FDSAFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXX

生物样本中抗生素耐药菌的快速检测方法

拉曼光谱法

RapiddetectionmethodforantibioticresistantbacteriainbiologicalsamplesRamanspectroscopy

（征求意见稿）

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT中国食品药品企业质量安全促进会??发布

T/FDSAXXXX—202X

T/FDSAXXXX—202X

前言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国食品药品企业质量安全促进会提出并归口。

本文件起草单位：河北省药品医疗器械检验研究院、

本文件主要起草人：李挥、

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生物样本中抗生素耐药菌的快速检测方法拉曼光谱法

1范围

本标准规定了生物样本中抗生素耐药菌的快速检测方法。

本标准适用于临床分离株、尿液等样本中抗生素耐药菌的快速测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成对本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

样品经过滤除去大分子、细菌培养、抗生素作用等方法，加表面增强试剂对待测液中的目标分子拉曼信号进行增强。用拉曼光谱仪采集样品的拉曼光谱信号进行分析，以重水标记特有的拉曼特征峰（2180cm-1）作为定性基准峰，建立方法数据库，实现待测样本中目标物的快速检测。

5试剂和材料

5.1试剂

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

二甲基亚砜。

甲醇。

0.1mol/L盐酸。

磷酸盐缓冲液。

重水（D2O）。

庆大霉素。

营养琼脂培养基：称取8g营养琼脂培养基，溶解于200mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟。

MH培养基：称取4.2gMH琼脂培养基，溶解于200mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟。

5.2材料

5.2.1塑料具塞离心管：2mL和10mL。

5.2.2移液吸头：200μL，1000μL和5000μL。

6仪器设备

6.1流式拉曼光谱仪

6.2稳频激光光源：发射波长为532±1nm，线宽＜0.1nm，能量≥250mW；光谱分辨率≤10cm-1；光谱响应范围300cm-1~2700cm-1，或大于该响应范围。

6.3移液器：0.1-2.5μL、2-20μL、10-100μL和100-1000μL。

6.4涡旋振荡器。

6.5离心机：转速≥10000转/min。

6.6电子天平：感量为0.01g和0.0001g。

6.7塑料具塞离心管：2mL和50mL

6.8移液吸头：10μL，200μL和1000μL。

6.9麦氏浊度仪。

6.10孵育箱。

7分析步骤

7.1取样制样

临床分离株：将平板上的单菌落挑取至含有MH培养基的玻璃管中，混匀；麦氏浊度仪检测为0.5，对照浊度表将菌悬液稀释至5×105CFU/mL；

尿液样品：取样品用5μm过滤器对尿液样本进行过滤取出大分子杂质，麦氏浊度仪检测菌悬液浊度，对照浊度表将菌悬液稀释至5×105CFU/mL；

7.2抗生素作用

将倍比稀释的各浓度梯度的抗生素分别与菌悬液混合。如庆大霉素，用一级水配制母液浓度为50mg/mL备用，将母液稀释至960μg/mL后，采用倍比稀释法在安全柜中完成各浓度梯度的抗生素配制，后续分别取20μL不同浓度庆大霉素加入到580μL菌悬液中，获得含有0.5-32μg/mL的菌悬液，混匀，37oC孵育1小时。

7.3重水标记

将重水使用0.22μm无机或有机滤膜配合注射器过滤灭菌，取一定量重水加入到孵育1小时的菌悬液中，混匀，重水终浓度为40%，37oC孵育2小时。

7.4离心清洗

孵育完成后，混合体系完全取出，将液体移至离心管中6500转/分钟离心3分钟，水洗三次，等体积水重悬。

7.5测定

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