分子克隆常用的载体.ppt

第三節???????真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的載體（共同特點）1.整合型載體（YIP）2.複製型載體（YRP）3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質粒三、動物細胞基因克隆的載體整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片段構成的。如Pyeleu10是由ColEI質粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構成，在細菌中複製、擴增，進入酵母後可整合表達。YIP型載體的特點是轉化率低(只有1-10轉化子/微克DNA)，但轉化子遺傳性穩定穩定，多用於遺傳分析工作。複製型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標記和複製子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構成的。因為它同時含有大腸桿菌和酵母的自主複製基因，所以能在兩種細胞中存在和複製。可以在兩種截然不同的生物細胞中複製的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），（如圖3-20）穿梭載體在基因工程中廣泛使用。YRP型載體轉化率高，拷貝也高，但不穩定，易丟失。附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質粒、2μm質粒以及酵母染色體的選擇標記構成。2μm質粒含有自主複製起始區（Ori）和STB區,STB序列能夠使質粒在供體細胞中維持穩定。利用2μm質粒，人們已經構建出許多YEP型載體。YEP型載體PYF92（如圖3-21）就是由酵母的2μm質粒、pBR322質粒和酵母的His3+(組氨酸)基因構成的。YEP型載體對酵母具有很高的轉化活性，一般為103-105轉化子/微克DNA。比YRP型載體更穩定，拷貝數也高（25-100個/細胞），是基因克隆中的常用載體。載體載體（Vector）：能攜帶外源基因導入受體細胞，這種運載工具稱載體。1.克隆載體:具組裝、複製、擴增功能。如：pBR322、pUC18/19等。2.表達載體:不僅具組裝、複製、擴增功能，還有轉錄表達功能。如：pBV220、pKK223-33.載體的種類：質粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動物病毒。共同特徵：①自主複製②易於擴增分離純化③有非必需區④有單一酶切位點（多克隆位點）單一酶切位點：一種酶在一個載體上只有一個酶切位點多克隆位點：一個載體上的某一個區域含有多個單一酶切位點⑤有選擇標記基因⑥表達載體還應有表達調控元件（啟動子、增強子、終止子,SD序列）質粒本質是細菌染色體以外的遺傳物質，是一種簡單的，環狀DNA分子，能自主複製。命名：前一個小寫p代表質粒，後兩個大寫英文字母代表發現者或實驗室，數字代表編號，如pBR322質粒。種類：F質粒：使宿主染色體上的基因通過性菌毛隨其一起轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中。R質粒：抗性因數，攜有一種或多種抗生素抗性基因轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中。Col質粒：有編碼大腸桿菌素基因質粒的類型和特性傳遞類型：①接合型：含有自主轉移基因，使質粒從一個細胞轉移到另一個細胞。如：F質粒、部分R、Col質粒②非接合型：不含有自主轉移基因，質粒不能自主從一個細胞轉移到另一個細胞。如：部分R、Col質粒（安全常用）複製類型：①嚴緊型：低拷貝1-3個拷貝/菌②鬆弛型：高拷貝10-60個拷貝/菌特性：自主複製、轉移、選擇標記遺傳特性、不相容性（同者相斥、異著共存）、分配功能（親代子代）特性：CopA和CopB基因1.複製：負調控RI質粒：repA基因表達複製PSC101：正調控是由ori複製子向左單向複製2.不相容性；在同一細胞中，同類質粒不能並存的現象。PUC18PUC19分配功能：質粒複製後，隨細胞分裂的進行，質粒分配到子細胞中。Triton和PEG化學提取法Triton和PEG處理法，此法簡單，不用昂貴的氯化銫，不必長時間的超速離心，費用較低，分離效果也很好，此法大體過程如下：培養菌體並加入氯黴素使質粒擴增→離心沉澱菌體。在TE緩衝液中懸浮→加入溶菌酶和去污劑Triton部分裂解菌體→35000r/min離心除去菌體，留上清液→上清液用酚處理除去蛋白質→用乙醇初步沉澱DNA→將DNA懸浮於TE緩衝液中→加聚乙二醇（PEG6000），在4℃下過夜→10000r/min離心15分鐘→DNA沉澱懸浮後再用乙醇沉澱→將DNA沉澱懸浮即得到提純的質粒DNA。煮沸裂解菌體，異丙醇沉澱質粒DNA該法簡便迅速