反义RNA的原理及其应用.pptVIP

反义RNA的原理及其应用实例制作人：余萍反义RNAA(antisenseRNA）：一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能，从而调控基因的正常表达。反义RNA技术的基本原理：利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA，然后转染受体细胞，则这一反插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA，对基因的表达进行调控，从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。一、复制水平DNA复制中的作用反义RNA作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA结合或作用于引物前体而抑制DNA复制，从而降低DNA的复制效率。E．coli的cole1质粒复制的前提是合成适当的RNA(RNAⅡ)，它自动折叠后与DNA模板结合形成DNA复制的引物，从复制起始点上游一445bp处开始，以另一DNA为模板反向转录的RNAI正好与RNA1I的结合，阻止了正常引物的产生，从而干扰复制的进行。反义RNA的作用机制主要表现在DNA复制、转录和翻译3个水平上。转录及转录后水平的作用反义RNA与mRNA5末端互补结合，阻断帽子结构形成；作用于外显子和内含子的连接区，阻碍前mRNA剪接；作用于polyA形成位点，阻碍mRNA的成熟及其向胞浆转运。在crp基因的ticRNA(transcriptioninhibitorycomplementaryRNA)负向自我调控中，ticRNA与erpmRNA的5端结合，形成类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构，以反式作用对转录过程本身进行调控J三、翻译水平翻译水平的作用反义RNA可直接与mRNA的SD序列(含RBS)或编码区(主要是AUG)结合，从空间上直接阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶mRNA。反义RNA与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成RNA—RNA双链结构，从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现反义RNA的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小分子RNA称为tcRNA，它们可以与肌球蛋白重链的RNA的polyA尾杂交而抑制正常的翻译过程。Audrey等J的研究表明FGF—ASRNA在翻译过程能有效地抑制FGF一2在哺乳动物细胞中的表达。反义RNA的重组DNA中只有启动子及终止子，当转染细胞后，重组DNA能自动表达反义RNA，并且重组DNA自身可以整合到宿主的基因组DNA中，或作为“附加体”长期存在。在原核细胞中，反义RNA以针对SD序列效果最好，而在真核细胞中以5端非编码区为标靶最有效。随着基因组草图的完成,人们研究的重点已转向对基因功能的研究,反义核酸技术无疑为这项宏伟的工程提供了一种有力的工具。病毒是对人和动植物危害极大的病原体,然而对病毒引起的疾病的治疗,目前尚无特效药物与方法。反义RNA却能特异性阻断病毒基因表达和抑制病毒的复制,从而激起许多科学工作者去探索反义RNA治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义RNA技术是将特定的病毒基因反向插人到表达险载体中,以构建反义RNA表达载体,再将重组体导人真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义RNA,从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制。文献报道,运用反义RNA技术己经成功地抑制疤病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等对培养的组织细胞的侵袭。用针对植物病毒的反义RNA已培育出具有抗病毒能力的植物。姚志强等针对不同靶位设计了10段互补反义核酸(DNA片段)，经模型筛选发现针对S基因起始区、SP2增强子帽区和polyA信号编码区的asONs作用最强，揭示反调节基因转录/翻译起始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。Gabo