华师分子生物学实验考试答案整理.docVIP

一、名词解释：

聚合酶链式反应

是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。

质粒

存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。

星号活性

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种星号活性可能是内切酶的一种普遍特性

（1）如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。

限制性内切酶

可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内

切酶，简称限制酶。

转化

是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。

转化子

受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象转化后的受体菌，称转化子transformant

重组子

两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。

重组子（recombinant)另一定义是指，含有重组DNA分子的转化细胞。

感受态细胞

细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法、RbCl(KCl等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Componentcells)。

深刻理解和掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理，以及溶液I、溶液II和溶液III的主要成分及其在实验中所起的作用。为何出现较多的RNA污染，如何解决RNA污染的问题？

（碱裂解可以利用变性和复性的差异较有效地区分质粒和较大的DNA（如基因组DNA），但是不能区分同样是较小分子的RNA和质粒DNA，因为两者虽然有单链和双链的区别，RNA内部可形成二级结构，但是他们的分子量差异不大，变性和复性行为上没有差异。加入RNA酶可水解RNA污染。）

基本原理

质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后，溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）EDTA（10mmol/L）

溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制，常温保存）

溶液Ⅲ

溶液I低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris?Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。

SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。

NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。

KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。K+会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。

如何判断DNA酶切是否完全？若没有完全酶切，应如何改进实验。

取未酶切处理和酶切处理的DNA样在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，与未酶切DNA电泳条带相比，酶切处理的DNA样品电泳速度较慢，条带滞后，则已完全酶切；若条带与未酶切处理条带一致，则完全没有酶切效果；若同时出现这样的两条带，则不完全酶切；

实验改进：影响酶切的因素：DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等

可通过增加限制酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异性的酶切

四、深刻理解和掌握蓝白斑筛选阳性重组子的原理。

蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个