DB13_T2456-2017_番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程_河北省.docxVIP

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DB13

B31

河北省地方标准

DB13/T2456—2017

番茄苗期抗黄化曲叶病

毒基因快速检测技术规程

河北省质量技术监督局

发布

DB13/T2456—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北省农林科学院提出。

本标准起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所。

本标准主要起草人：吴志明、李亚栋、耿保进、高慧敏、田玉、孙英焘、孙世卫、寇慧苹、冯贺

敬。

I

DB13/T2456—2017

番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程

1

范围

本标准规定了番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因的检测前准备和检测技术。

本标准适用于番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因Ty-1、Ty-2、Ty-3/3a的分子快速检测。

2

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

番茄黄化曲叶病毒病（Tomatoyellowleafcurlvirusdisease）

为病毒性病害，病原为番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCVorTY），

病原特征及发病症状见附录C。

2.2

番茄抗黄化曲叶病毒基因

2.2.1

3

组织研磨仪、恒温水浴锅、离心机、高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4℃、-20℃、-80℃)、

DNA提取液(CTAB)、氯仿/异戊醇(24/1)、乙醇、异丙醇、蒸馏水、双蒸馏水（ddH2O）、TE缓冲液

(Ph=8.0)、50xTAE缓冲液、Goldview、DM2000、琼脂糖、Taq酶等。

1

DB13/T2456—2017

表1给出了抗TYLCV的抗病基因扩增引物。

表1Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a检测引物

基因

染色体

引物

序列(5′-3′)

扩增产物(bp)

标记类型

Ty1正向

Ty1反向

Ty1-3

TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC

AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC

AAACGCTCTTCTTCCCCTCG

Ty-1

6

984（抗）

1434（感）

SNP

Ty1-4

AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA

AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC

AGTGTACATCCTTGCCATTGACT

GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC

GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC

Ty2正向

Ty2反向

Ty3正向

Ty3反向

Ty-2

11

6

194（抗）

494（感）

320（感）

SCAR

SCAR

Ty3450（抗）

Ty3a630（抗）

Ty-3/3a

3.4DNA提取液配制

配制以下DNA提取液：

a)100mmol/LTris(pH=8.0)；

b)50mmol/LEDTA；

e)0.8%皂土（W/V）。

4

d)6000rpm以上室温离心10min，吸取上清液400μL至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙

醇，上下颠倒混匀，室温静置5min；

e)10000rpm以上离心10min，弃上清液；

加入1ml70%乙醇洗涤，用手指轻弹使沉淀漂浮于乙醇中；

g)6000rpm以上离心5min，弃上清液，将离心管倒扣在滤纸上，风干DNA；

加入50μLTE缓冲液；

2

DB13/T2456—2017

i)

完全溶解后，取4μLDNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，剩下的置于-20℃或-80℃冰箱

中保存。

4.3Ty-1、Ty-2和Ty-3/3a检测

4.3.1PCR检测反应体系

PCR反应液体积为20μL，组分配制应符合表2的规定。

表2PCR反应体系

反应组分

原浓度

终浓度

1.5ng/μL～2.5ng/μL

1×buffer

反应体积μL

DNA

10×buffer

dNTP

30ng/μL～50ng/μL

10×buffer

2.5mmol/L

5U/μL

1

2

0.15mmol/L

0.2U/μL

1.6

0.2

1

Taq酶

正向引物

反向引物

ddH2O

10μmol/L

10μmol/L

---

0.5μmol/L

0.5μmol/L

---

1

13.2

4.3.2Ty-1、Ty-2和Ty-3/3aPCR反应程序

a)94℃预变性5min；

b)94℃变性50s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，共5个循环；

c)94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；

d)72℃延伸10min，4℃保存。

5

检测结论判定依据检测结