DB22_T2079-2014_皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法_吉林省.docxVIP

ICS59.140.20

B45

DB22

吉林省

地

方

标

准

DB22/T2079—2014

皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法

Detectionofanimal-derivedingredientsinleatherbyrealtimePCRmethod

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2079—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国延边出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘金华，聂丹丹，刘韬，王玮琳，刘阳，吴连鹏，王宁，罗雁菲。

I

DB22/T2079—2014

皮革中动物源性成分检测实时荧光PCR法

1范围

本标准规定了天然皮革中动物源性成分的定性检测方法。

本标准适用于天然皮革牛、羊、猪成分的定性PCR检测，不适用于再生革、人造革和合成革。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用CTAB

裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR

检测；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增

反应中每一个循环产物荧光信号的扩增曲线判定，实现对皮革中牛、羊、猪源性成分的定性分析。

4.4无水乙醇(absoluteethanol)。

4.8苯酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1,体积比）。

4.10Tris-HCl：在800mL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入60mL浓盐酸，

冷却至室温后调节pH值至7.5，加水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。

4.111.2mol/L氯化钠溶液

4.12CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA

(pH8.0)。

4.13TE缓冲液：配制每升TE缓冲液，应在800mL水中依次加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)10

mL,O.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL，加水定容至1L，分装后121℃高压灭菌20min。

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DB22/T2079—2014

4.14CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。

4.15蛋白酶k溶液（20mg/mL）

4.16引物及探针序列：天然皮革中牛、羊、猪PCR检测引物信息见表1。

表1牛、羊、猪PCR检测引物信息

检测基因

引物序列

基因性质

适用范围

皮革及其加

工品

哺乳动物特上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’

12SrRNA基因

异基因

下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’

探针：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’

上游引物：5’-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3’

牛内源基因

牛生长素基因

牛皮及其加

下游引物：5’-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3’

探针：5’-（FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3’

上游引物：5-ACACAACTTCTACCACAACCC-3

工品

羊内源基因

猪内源基因

羊线粒体

羊皮及其加

下游引物：5-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3

ATPase亚基

工品

探针：：5-(FAM)–ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3’

上游引物：5-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’

下游引物：5-TGCCAAGCGGGTTGCT-3

猪线粒体

猪皮及其加

D-LOOP基因

工品

探针：5-（FAM）-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA-(TAMRA)-3’

5.1实时荧光PCR检测系统。

5.2高速冷冻离心机(12000r/min)。

5.3涡旋混合器。

5.5微量移液器：0