DB22_T2078-2014_鹿源结核杆菌基因分型MLVA法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

B41

DB22

吉

林

省地方标准

DB22/T2078—2014

鹿源结核杆菌基因分型MLVA法

MLVAMethodforGenotypingofMycobacteriumTuberculosisfromDeer

吉林省技术质量监督局

发布

DB22/T2078—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研

究院。

本标准主要起草人：王春雨、杨莉、李忠平、石建平、王全凯、孙磊、宋立品、孔德鑫。

I

DB22/T2078—2014

鹿源结核杆菌基因分型MLVA法

1范围

本标准规定了鹿源结核杆菌MLVA分型方法。

本标准适用于鹿源结核杆菌MLVA基因分型。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）

适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范

3缩略语

3.1MLVA:多位点可变数目串联重复序列分析

3.2DNAmarker：脱氧核糖核酸分子标记

3.3SDS:十二烷基硫酸钠

3.5Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液

3.6EDTA：乙二胺四乙酸

多位点数目可变串联重复序列分型(multiplelocusVNTRsanalysis，MLVA)以PCR扩增为基础，利

用PCR方法扩增散在于菌株基因组中的不同独立位点可变数目串联重复序列(VNTR)，对扩增产物进行DNA

分析确定长度，根据不同位点重复序列单拷贝长度计算出拷贝数，由不同位点拷贝数组成菌株基因型。

1

DB22/T2078—2014

6.310%SDS：10g的SDS粉末溶解于70ml双蒸水中，定容到100ml。

6.4PCR扩增预混液

6.51MTris-HCl(pH8.0):称取Tris碱6.06g，加双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至8.0，

定容至50ml。

6.60.5MEDTA(pH8.0):称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加双蒸水35ml，搅拌，用NaOH调pH至

8.0，定容至50ml。

6.7苯酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25；24；1）

6.8三氯甲烷

6.9CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA

(pH8.0)。

6.10CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。

6.11TE缓冲液:称取1MTris-HCl(pH8.0)1ml和0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，加加双蒸水定

容至100ml。

6.12PCR引物

本规程选择13个MLVA位点作为扩增位点，各位点引物见表1，引物保存于-20℃，临用前取出用双

蒸水稀释为10pmol/μl，置-20℃保存。

表1MLVA位点扩增引物

引物名称

QUB-11ba

QUB-11bb

MIRU4a

MIRU4b

MIRU40a

MIRU40b

MIRU31a

MIRU31b

Mtub4a

碱基数

24

18

19

19

22

24

24

19

25

23

24

24

23

25

20

20

18

28

23

25

24

24

22

25

24

AACGCTCAGCTGTCGGAT

Mtub34

MIRU2

2

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MIRU2b

TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT

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7仪器与设备

7.1生物安全柜

7.2梯度PCR仪

7.3毛细管电泳分析系统

7.4高速冷冻离心机：最高离心力可达15000×g以上

7.5高压灭菌器

7.6涡漩振荡器

7.7移液器

8操作步骤

8.1DNA提取

8.1.1将结核杆菌置高压灭菌器中121℃下15min灭活，取2-3个菌落或50μl菌液放入离心管中，

加入200μlTE缓冲液，加10%SDS至终浓度为1%，置85℃～90℃水浴10min。

8.1.2加入1.0mLCTAB裂解液及50μL蛋白酶K溶液，涡旋震荡30s后，颠倒混合5次，65℃

水浴过夜（1