DB22_T1673-2012_莱姆病螺旋体的检测荧光PCR法_吉林省.docxVIP

ICS11.020

C62

DB22

备案号：35806-2013

吉林省地

方

标

准

DB22/T1673—2012

莱姆病螺旋体的检测荧光PCR法

DetectionofBorreliaburgdorfe——FluorescencePCR

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T1673—2012

前

言

本标准依据GB/T1.1-2009、GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本标准主要起草人：刘阳、王玮琳、丁旭、孙舒、刘韬、刘金华、牛茜、罗雁非、郑旭。

I

DB22/T1673—2012

莱姆病螺旋体的检测荧光PCR法

警告——为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处

置，并按GB/T19489中的有关规定执行。

1范围

本标准规定了莱姆病螺旋体荧光PCR检测方法

本标准适用于莱姆病螺旋体的实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的

版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

GB/T19489实验室生物安全通用要求

3缩略语

Tm值:核酸融解温度（Meltingtempreture）。

实时荧光PCR方法，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，

最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧

光探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针

上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积

累荧光。MGB探针（Minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，5′端标记FAM

荧光素为报告基团，3′端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，降低了本底

信号的干扰。此外，MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(Dehydrocyclopyrroindole

tripetide,DPI3)，可以稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达到较高的Tm

值。

1

DB22/T1673—2012

5试剂与材料

除另有说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，所用水为符合GB/T6682中规定的二级水。

5.1试剂配制

见附录A。

5.2引物及探针

上游引物：5′–GCTGTAAACGATGCACACTTGGT-3′

下游引物：5′-GGCGGCACACTTAACACGTTAG-3′

探针：6-FAM-TTCGGTACTAACTTTTAGTTAA-MGBNFQ

5.3质控品

空白对照：以水代替DNA模板。

阴性对照：非目标菌的DNA作为荧光PCR反应的模板。

阳性对照：莱姆病螺旋体标准株ATCC35210DNA作为荧光PCR反应的模板。

6仪器设备

取单只活蜱,用70%乙醇浸泡,生理盐水清洗3次,滤纸吸干后。将单只蜱放入1.5mL离心管中，加入

500μLTE缓冲液，用匀浆仪研碎。匀浆液10000r/min,离心2min，弃上清，沉淀备用。

500μLEDTA抗凝血液中加入1mL无菌水,5000r/min,离心2min，弃上清，沉淀备用。新鲜血样

品如不能立即用于抽提DNA,可置于4℃保存,但不要超过2个月,欲长期储存,分装-20℃储存。

2

DB22/T1673—2012

25mg～30mg动物组织(新鲜或冷冻组织均可),放入1.5mL离心管中,加入500μLTE缓冲液,用

匀浆仪研碎。匀浆液10000r/min,离心2min，弃上清，沉淀备用。

8检测程序

8.1样品DNA提取

在上述样品沉淀中加入560μLTE缓冲液，反复吹打使之重悬，加入30μL的10%SDS和3μL蛋白酶K

（20mg/mL），混匀，37℃孵育1h；加入100μL5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80μLCTAB/NaCl

溶液，混匀，65℃温育10min；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心5min，将上清

转入一新离心管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，10000r/min离心15min,去

上清；7