DB51T 1302-2011 绵羊肺炎支原体PCR检测技术规范.docxVIP

ICS11.220B41

备案号：30905-2011DB51四川省地方标准

DB51/T1302—2011

绵羊肺炎支原体PCR检测技术规范

TechnicalSpecificationforPCRDetectionMethodofMycoplasmaovipneumoniae

2011-06-27发布2011-07-01实施

四川省质量技术监督局发布

I

DB51/T1302—2011

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语与定义 1

4设备和试剂 1

5DNA提取 2

6PCR扩增 3

7PCR产物的电泳检测 3

8结果判定 3

附录A（资料性附录）试剂配制 5

II

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前言

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。

本标准由四川省质量技术监督局批准发布。

本标准起草单位：西南民族大学四川省畜禽繁殖改良总站。本标准主要起草人：杨发龙岳华王永汤承傅昌秀。

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绵羊肺炎支原体PCR检测技术规范

1范围

本标准规定了绵羊肺炎支原体的PCR（聚合酶链式反应）检测方法。本标准适用于绵羊肺炎支原体的检测与鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语与定义

下列术语和定义适用于本标准。3.1

聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）

是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的DNA片段。3.2

引物primer

是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条DNA模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条DNA模板链互补。

4设备和试剂

4.1主要仪器和设备

4.1.1PCR扩增仪

4.1.2电泳仪、水平电泳槽

4.1.3凝胶成像系统

4.1.4冷冻高速离心机

4.1.5微量高速离心机（适合于对PCR反应管进行离心操作）

4.1.6高压灭菌锅

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4.1.7恒温水浴锅

4.1.8移液器（0.1μL-10μL、2μL-20μL、20μL-200μL、200μL-1000μL）

4.2主要试剂

4.2.1引物（10μmol/L）

P1：5’-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3’P2：5’-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3’

4.2.2DNA提取试剂

蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。

4.2.3PCR反应试剂

TaqDNA聚合酶（5U/μL）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP（每种浓度为2.5mmol/L）、10×PCRBuffer(无Mg2+)。

4.2.4STE缓冲液（见附录A）

4.2.5TAE电泳缓冲液（见附录A）

4.2.66×上样缓冲液（6×LoadingBuffer）

4.2.7琼脂糖（电泳级）

4.2.8溴化乙锭溶液（1mg/mL）

4.2.9DNA分子量标准（100bp，200bp,300bp,400bp,500bp,600bp）4.2.10水

所用水应符合GB/T6682中三级水（三蒸水）规格。

5DNA提取

5.1样本处理

5.1.1组织样本

肺等组织样本，按1g加入1mL的STE，进行研磨，3000r/min进行离心10min，取上清液，12000r/min进行离心20min，弃上清，沉淀用于DNA提取。

5.1.2棉拭子

将鼻腔拭子等棉拭子浸入1mL的STE缓冲液中30min，反复挤压，然后以12000r/min离心20min，弃去上清，收集沉淀用于DNA提取。

5.1.3胸腔渗出液

取500μL胸腔渗出液，加入500μLSTE缓冲液，混匀，12000r/min离心20min,弃上清，收集沉淀用于DNA提取。

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