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【百欧泰生物】带你了解荧光标记技术

荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到合适的激发光照射时，可跃迁成为激发态，当从激发态恢复至基态时，发出荧光。利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，可利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。比如说某些小分子荧光素或生物素等经过活化，在一定的pH及温度范围内，可以专一地与蛋白或者多肽上的伯胺基反应，形成稳定的酰胺键，从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。另外一些荧光素经过活化后，在一定条件下，可以与蛋白或抗体自身的，或额外引入的其他化学反应基团发生专一性反应，形成稳定的化学键，从而实现标记物与蛋白或抗体的偶联。

荧光标记蛋白技术

1.荧光蛋白标记(基因编码荧光标记)

荧光蛋白(FluorescentProteins,FPs)是一类由基因编码、可自发形成荧光发色团的蛋白，典型代表为绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物(如YFP、RFP、mCherry)。其优势在于无需额外标记即可在活细胞内表达和观测。

常用荧光蛋白及其特性：

1.1GFP(绿色荧光蛋白):激发波长488nm,发射波长507nm,适用于常规细胞成像。

1.2mCherry(红色荧光蛋白):激发波长587nm,发射波长610nm,适用于多色标记和深层

组织成像。

1.3新型荧光蛋白：如近红外荧光蛋白(iRFP)适用于活体动物成像，减少组织自发荧光干扰。

2.化学偶联荧光标记

对于无法通过基因编码标记的蛋白质(如纯化后的重组蛋白或抗体),可采用化学偶联方法引入荧光染料。

常用荧光染料：

2.1FITC(异硫氰酸荧光素):激发/发射波长495/519nm,适用于流式细胞术。

2.2Cy系列(如Cy3、Cy5):具有更高光稳定性，适用于共聚焦显微镜。

2.3AlexaFluor系列：如AlexaFluor488(类似FITC但更稳定),适用于超分辨显微镜(STED、STORM)。

荧光标记抗体技术

1.标记方法

抗体(如IgG)的荧光标记需兼顾荧光信号强度与抗体活性，常用方法包括：

1.1直接标记：将荧光染料共价结合至抗体的Fc或Fab区(如IgG的赖氨酸残基)。

1.2间接标记：使用二抗(如抗小鼠IgG-Cy3)放大信号，提高检测灵敏度。

2.标记位点优化

2.1Fab区标记：可能影响抗原结合能力，需控制标记比例(通常每个抗体结合3-6个荧光分子)。

2.2Fc区标记：减少对抗原结合的影响，适用于功能性实验。

3.新型标记技术

3.1量子点(QDs)标记：半导体纳米颗粒，具有窄发射峰、抗光漂白特性，适用于多重检测。3.2时间分辨荧光(TRF)标记：如铕(Eu3+)螯合物，通过延迟检测降低背景噪声，用于高灵敏度免疫分析(如ELISA)。

荧光标记流程

1.蛋白溶液配置：

溶解蛋白时，要根据推荐的溶剂进行溶解，避免使用含伯胺(例如Tris,Glycine)或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白会发生竞争反应降低标记效率。低浓度的叠氮化钠(≤3mM或

0.02%)或Thimerosal(≤0.02mM或0.01%)不会显著干扰蛋白标记，但是20-50%的甘油会降低标记效率。蛋白浓度过低会大大影响标记效率，一般浓度不小于0.5mg/mL。若蛋白浓度过低，可用超滤管浓缩蛋白。

2.染料溶液配置：

使用无水DMSO配制染料溶液，染料在DMSO稳定性较好，剩余染料溶液可在-20℃分装保存1个月。如果是水溶解，染料有易被水解的性质，建议现配现用。

3.蛋白染料配比：

推荐染料与蛋白的摩尔比在5:1-20:1。染料过少，反应不完全，标记量太少，染料过多，则不易纯化。

4.孵育：

一般将染料和蛋白一起室温孵育2h即可完成结合。

5.纯化：

荧光标记结束后，需要纯化蛋白去掉多余未结合染料防止其对实验的干扰，常用的纯化工具为亲和层析柱和透析袋。

6.检测：

(1)肉眼观察，根据纯化原理可以得知，如果得到的产物有颜色，默认标记成功；

(2)荧光显微镜观察，通过荧光显微镜在对应通道进行拍摄，如果观察到特定形态荧光信号即为标记蛋白；

(3)蛋白电泳实验，标记后蛋白本身分子量会增大，蛋白存在微小向上拖带可以证明标记成功；

(4)使用分光光度计测定F(荧光素)和P(抗体蛋白)的比值(F/P),F/P的比值反映荧光蛋白的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1～3。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，标记效率低。

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