DB22_T2691-2017_明胶中貉源性成分定性检测实时荧光PCR法_吉林省.docxVIP

ICS65.020.30

B43

DB22

备案号：56304-2017

吉林省地方标准

DB22/T2691—2017

明胶中貉源性成分定性检测实时荧光PCR

法

IdentificationofRaccoonDogderivedmaterialsingelatin-RealtimePCRmethod

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2691—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中华人民共和国吉林

市出入境检验检疫局，虎林出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：刘金华，王岸英，刘婧，聂丹丹，罗雁非，王玮琳，曲辉，吴鑫本。

I

DB22/2691—2017

明胶中貉源性成分定性检测实时荧光PCR法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问

题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步

骤、试验数据处理。

本标准适用于明胶中貉源性成分的实时荧光PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法

GB6783食品安全国家标准食品添加剂明胶

GB/T14699.1饲料采样

利用实时荧光PCR技术，根据貉物种的特异性基因序列对貉源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细

胞，用酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光

PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质的探针进行貉源性成分的实时荧

光PCR扩增，根据对PCR扩增反应中荧光信号生成扩增曲线的判定，实现对貉源性成分的定性分析。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。

4.1裂解液:

2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)；100mmol/LTris(tris

hydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)；1.4mol/LNaCl；20mmol/LEDTA(ethylene

1

DB22/2691—2017

4.7异丙醇。

4.870%乙醇。

4.9哺乳动物特异基因（内参基因）引物和探针

哺乳动物特异基因上游引物：5’-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3’

哺乳动物特异基因下游引物：5’-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3’

哺乳动物特异基因探针：5’-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3’

4.10貉特异基因用引物及探针

貉特异基因上游引物：5’-CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC-3’

貉特异基因下游引物：5’-GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA-3’

貉特异基因探针：5’-（FAM)-CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC-(TAMRA)-3’

5

仪器和设备

5.1

5.2

5.3

5.4

5.5

实时荧光PCR仪。

高速冷冻离心机(不少于12000r/min)。

涡旋混合器。

分析天平：感量0.01g。

微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，

100μL～1000μL。

5.6

核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

5.7恒温水浴箱或金属浴。

按照GB6783对食用明胶采样（5.4），按照GB/T14699.1对饲料明胶采样，将实验样品粉碎，充分

混匀后待用。

7试验步骤

7.2.1进行样品检测时，应同时对内参基因及貉特异基因进行扩增，并设立阴性对照、空白对照和阳

性对照实验（5.1）。

7.2.2实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：95℃/10min，1个循环；95℃/15s，

60℃/1min，45个循环，在每次循环的60℃/1min时收集荧光。

7.2.3