第21章常用分子生物学技术的原理及其应用.pptVIP

第94页，共138页，星期日，2025年，2月5日A、制备基因敲除的胚胎干细胞（同源重组）B、制备基因敲除动物（小鼠）第95页，共138页，星期日，2025年，2月5日（二）、基因敲除的原理与程序A、制备基因敲除的胚胎干细胞1、打靶载体的构建：在一克隆载体上组装包括，待敲除的目的基因（同源臂），用于筛选的新霉素（Neor）基因和胸苷酸激酶基因(tk)。2、将构建的打靶载体转入胚胎干细胞，(为使靶载体上的新霉素基因能与干细胞内的目标基因发生同源重组而剔除目标基因)。3、筛选基因敲除的胚胎干细胞第96页，共138页，星期日，2025年，2月5日待剔除基因克隆克隆载体重组载体切割基因使待剔除基因失去活性阳性标记基因Neor连接HSV-tk打靶载体第97页，共138页，星期日，2025年，2月5日一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术第62页，共138页，星期日，2025年，2月5日标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。第63页，共138页，星期日，2025年，2月5日标签融合蛋白沉淀实验流程示意图第64页，共138页，星期日，2025年，2月5日（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途酵母活化因子GAL4baitprey第65页，共138页，星期日，2025年，2月5日酵母双杂交技术（THS、Y2Ｈ）概念：是一种用于筛选蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术，主要通过将被研究的蛋白质融合到一个转录激活蛋白的两个独立的结构域之间(结合结构域与激活结构域）进行操作。b.1989年，由Song和Field建立关于转录激活因子第66页，共138页，星期日，2025年，2月5日酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当猎物蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究原理第67页，共138页，星期日，2025年，2月5日prey酵母活化因子GAL4第68页，共138页，星期日，2025年，2月5日BD基因AD基因第69页，共138页，星期日，2025年，2月5日转录调节因子结构DNA结合域转录激活域TF蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域）谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域第70页，共138页，星期日，2025年，2月5日酵母双杂交技术的应用(1）、检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）、研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因（诱饵蛋白）筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。第71页，共138页，星期日，2025年，2月5日电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，且已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术电泳迁移率变动测定第72页，共138页，星期日，2025年，2月5日第73页，共138页，星期日，2025年，2月5日第74页，共138页，星期日，2025年，2月5日A）DNAtobeanalyzed第75页，共138页，星期日，2025年，2月5日复习题1、PCR的基本原理？PCR反应体系包括哪些组分?常用PCR有哪些及其应用。2、DNA测序需用哪些酶与底物？简述DNA测序的原理。3、简述酵母双杂交原理？钓饵蛋白和猎物蛋白的作用及如何证明蛋白质之间发挥了相互作用。4、比较转基因，动物克隆和基因敲除的概念。第76页，共138页，星期日，2025年，2月5