克隆操作中使用的工具酶.ppt

活性：5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性。无5`→3`外切酶活性。用途：（1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端；（2）催化合成cDNA第二链；（3）DNA序列测定3.2Klenow聚合酶第30页，共52页，星期日，2025年，2月5日EcoRI酶切末端同位素标记的EcoRI酶切末端α-32P-dATPBack第31页，共52页，星期日，2025年，2月5日（1）显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90%；93℃反应2h残留活性60%；94℃反应2h残留活性40%。（2）应用：①特定DNA片段的体外扩增；②DNA测序。3.3TaqDNA聚合酶Back第32页，共52页，星期日，2025年，2月5日（1）定义：RNA指导下的DNA聚合酶(reversetranscriptase)。（2）活性：5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。3.4逆转录酶第33页，共52页，星期日，2025年，2月5日逆转录酶的活性第34页，共52页，星期日，2025年，2月5日（3）用途①在体外以mRNA为模板合成cDNA；②对有5`突出末端的DNA片段作末端标记或补平；③双脱氧法测序；④以DNA或RNA为模板合成核酸探针。Back第35页，共52页，星期日，2025年，2月5日（1）活性：5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性。注意：3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强；高浓度dNTP环竟下前者活性更强。（2）应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端3.5T4DNA聚合酶Back第36页，共52页，星期日，2025年，2月5日（1）活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性。但无5`→3`外切酶活性；（2）特点：极佳的连续合成能力（3）应用：①长DNA片段体外扩增；②通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；③补平：使双链DNA5`或3`突出末端变平末端。3.6T7DNA聚合酶Back第37页，共52页，星期日，2025年，2月5日关于克隆操作中使用的工具酶第1页，共52页，星期日，2025年，2月5日第一节基因操作工具酶第2页，共52页，星期日，2025年，2月5日酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠS1核酸酶Klenow酶DNA酶ⅠTaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶第3页，共52页，星期日，2025年，2月5日主要内容1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修饰酶5小结第4页，共52页，星期日，2025年，2月5日酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探针；2合成cDNA第二链；3填补双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第5页，共52页，星期日，2025年，2月5日1限制性核酸内切酶1.1引言1.2命名1.3分类1.4活性及影响因素Home第6页，共52页，星期日，2025年，2月5日核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（1）按作用对象分:DNAaseRNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分：EndonucleaseExonuclease1.1引言—两个概念第7页，共52页，星期日，2025年，2月5日限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Res