分子生物学6 基因工程课件.ppt

分子生物学6（三）用逆转录酶合成cDNA以mRNA或RNA为模板经RT合成cDNA。然后经过基因克隆，从而获得某种特定的基因。适于高丰度的mRNA。分子生物学6（四）PCR或RT-PCR根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。分子生物学6三种不同引物引导的RT-PCR示意图分子生物学61.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目的基因采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。（五）从基因组文库和cDNA文库筛选目的基因

分子生物学6组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因分子生物学62.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为cDNA文库。分子生物学6mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT分子生物学62.pUC18/19质粒有一个抗性基因，可用来筛选转化子。有一个lacZ基因片段，编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片段（α）片段，某些改造的宿主细胞可表达β-半乳糖苷酶的羧基端片段，质粒和宿主细胞共表达时才具有β-半乳糖苷酶的活性，可使生色底物X-gal降解产生兰色的化合物，这种现象称α-互补。分子生物学6pUC18/19质粒的特点①具有更小的分子量和更高的拷贝数，500?700个/细胞。②lacZ基因赋予质粒组织化学染色特性，便于检测重组体。③具有多克隆位点，便于外源基因插入。分子生物学6质粒pBR322质粒pUC分子生物学63.穿梭质粒具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒。例如：大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒；大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。重组DNA的操作在大肠杆菌中进行，然后转入分支杆菌和酵母中表达。分子生物学62、噬菌体1．λ噬菌体（λbacteriophage，phage)2．M13噬菌体（M13phage）分子生物学61．λ噬菌体（λbacteriophage，phage）(1)生活周期：分为lytic和lysogenic期基因组结构：野生型为双链线性分子，在宿主细胞中成环状。左侧（包装）、中间（非必须、整合/切离、重组）、右侧（裂解、调控）分子生物学6λ噬菌体的粘性末端及其环化分子生物学6(2)λ噬菌体的包装75%或105%长度的DNA《基因组的包装》可以包装中间的非必须区可插入9-23kbp的外源DNA（replacementvector）左右臂连接的片段过小不能包装（选择标志）分子生物学6(3)λ噬菌体改造的载体由λ噬菌体改造的载体已有100多种分为两类：插入型载体，如λgt系列置换型载体，如EMBL和Charon系列分子生物学62．M13噬菌体（M13phage）大肠杆菌纤维状噬菌体，基因组DNA为全长6.5kb的闭环ssDNA，感染细菌后呈复制型dsDNA（RFDNA）。载体特点：a.允许包装大于病毒单位长度的外源DNA，一般DNA测序的插入片段1kb；b.感染细菌后，复制环状ssDNA，经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不溶菌。c.分离ssDNA容易。如含有插入DNA，可用于测序、制备杂交探针、定点突变研究。分子生物学6