分子杂交技术.pptVIP

白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日（2）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。

第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日（3）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。第36页，共50页，星期日，2025年，2月5日关于分子杂交技术第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日第一节分子杂交的原理核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短（如20～30个核苷酸），则难免会出现准确性差的假阳性现象。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。第3页，共50页，星期日，2025年，2月5日杂交的双方：探针和要检测的核酸。将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。被检测的核酸：克隆化的基因组DNA提纯的细胞总DNA细胞内杂交（细胞原位杂交）细胞总RNA第4页，共50页，星期日，2025年，2月5日变性复性DNA-DNA杂交双链分子第5页，共50页，星期日，2025年，2月5日杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。第6页，共50页，星期日，2025年，2月5日一、DNA变性与复性（一）DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。第7页，共50页，星期日，2025年，2月5日GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3第8页，共50页，星期日，2025年，2月5日（二）复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第9页，共50页，星期日，2025年，2月5日2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子第10页，共50页，星期日，2025年，2月5日二.分子杂交的一般程序待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针