核酸的分离纯化 (2).pptVIP

2．细菌的收集细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净第55页，共88页，星期日，2025年，2月5日 碱裂解法 煮沸法SDS裂解法Triton-溶菌酶法3．细菌的裂解方法4．质粒DNA的提取适用于大质粒DNA不适宜含糖高的菌株如HB101第56页，共88页，星期日，2025年，2月5日二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其他方法一、碱裂解法五、质粒DNA的纯化第57页，共88页，星期日，2025年，2月5日一、碱裂解法在强碱（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。第58页，共88页，星期日，2025年，2月5日细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中第59页，共88页，星期日，2025年，2月5日第60页，共88页，星期日，2025年，2月5日二、煮沸裂解法将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。第61页，共88页，星期日，2025年，2月5日质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后回收上清液中的质粒DNA第62页，共88页，星期日，2025年，2月5日1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0第23页，共88页，星期日，2025年，2月5日荧光光度法：EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。第24页，共88页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖凝胶电泳：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状3.完整性鉴定第25页，共88页，星期日，2025年，2月5日DNA的降解第26页，共88页，星期日，2025年，2月5日完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。沉降系数大，电泳迁移率低，荧光强度高沉降系数小，电泳迁移率高，荧光强度低第27页，共88页，星期日，2025年，2月5日28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染第28页，共88页，星期日，2025年，2月5日第29页，共88页，星期日，2025年，2月5日（二）核酸的保存

1.DNA的储存2.RNA的储存第30页，共88页，星期日，2025年，2月5日

溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时DNA易变性。1.DNA的保存第31页，共88页，星期日，2025年，2月5日2.RNA的保存RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理第32页，共88页，星期日，2025年，2月5日第二节真核基因组DNA的分离纯化

第33页，共88页，星期日，2025年，2月5日生物体组织细胞玻棒缠绕法酚抽提法基因组DNA粗品PFGE分离特定的DNA片段AGE分离PAGE分离乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品精分离粗分离前处理离子交换层析纯化有机溶剂抽提细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放甲酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线第34页，共88页，星期日，2025年，2月5日基因组DNA的提取酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀第35页，共88页，星期日，2025年，2月5日血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒