DBS13 001-2015 食品安全地方标准 食品中诺如病毒检测.docxVIP

DBS13

河北省地方标准

DBS13/001—2015

食品安全地方标准食品中诺如病毒检测

2015-04-23发布2015-05-01实施

河北省卫生和计划生育委员会发布

I

DBS13/001—2015

前言

本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。

本标准于2015年4月23日首次发布。

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食品安全地方标准食品中诺如病毒检测

1范围

本标准规定了贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。

本标准适用于贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

诺如病毒norovirus

诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为26nm～35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链RNA，组成长约7kb～7.5kb，电镜下缺乏显著的形态学特征，负染色电镜照片显示，诺如病毒是具有典型的羽状边缘、表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒共可分为GⅠ~GⅤ5个基因型，其中感染人的主要是GⅠ型和GⅡ型。

3设备和材料

3.1电子天平：感量0.1g。

3.2组织匀浆器或其他可以破碎样品的工具。

3.3普通冰箱：2℃~8℃。

3.4超低温冰箱：-80℃±5℃。

3.5高速冷冻离心机：最大离心力大于15000g。

3.6恒温水浴箱或金属浴：37℃~65℃。

3.7PCR扩增仪。

3.8实时荧光PCR扩增仪。

3.9电泳仪。

3.10凝胶成像系统。

3.11震荡混匀器。

3.12电热干燥箱。

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3.13pH计。

3.14水过滤系统。

3.15微量可调移液器：1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。

3.16洗耳球或电动移液器。

3.17无RNA酶的玻璃容器、微量加样器吸头、无菌50mL离心管、无菌1.5mL离心管和PCR管。

3.18无RNA酶的一次性移液管：10mL、25mL。

3.19混合硝酸纤维素膜：孔径0.22μm。

4试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。

4.1无RNA酶的超纯水：见附录A.1。

4.2甘氨酸缓冲液：见附录A.2。

4.35XPEG8000溶液：见附录A.3。

4.42.5mol/L氯化镁(MgCl2)溶液：见附录A.4。

4.5牛肉膏-甘氨酸洗脱液:见附录A.5。

4.6氯仿。

4.71mol/L盐酸溶液。

4.81mol/L氢氧化钠溶液。

4.9病毒RNA提取试剂盒。

4.10TaqDNA聚合酶：-20℃保存，避免反复冻融。

4.11逆转录酶：-20℃保存，避免反复冻融。

4.12RNA酶抑制剂：-20℃保存，避免反复冻融。

4.13dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。

4.14引物和探针：使用浓度为25μmol/L，-20℃保存，引物和探针序列见表1和表2。

表1普通RT-PCR检测引物

检测的病毒类群

引物序列

片段大小/bp

GI和GII

正向引物F:5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’

326

反向引物R:5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’

3

表2实时荧光RT-PCR检测引物和探针

检测的病毒类群

引物和探针序列

片段大小/bp

GI

正向引物F:5-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’

反向引物R:5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’

探针:5’-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-3’

86

GII

正向引物F:5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’

反向引物R:5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’

探针:5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA-3’

89

4.151×TAE：见