生物化学技术第十八章电泳课件.ppt

通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定采用琼脂糖凝胶电泳法；若需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离线性DNA时，迁移率与其分子量密切相关，与碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。第三节琼脂糖凝胶电泳第94页，共125页，星期日，2025年，2月5日DNA的凝胶电泳第95页，共125页，星期日，2025年，2月5日连续的盘状凝胶电泳和垂直板电泳连续：缓冲液、pH、凝胶孔径都相同只有分离胶、无浓缩胶分离效应：电荷效应和分子筛效应用途：分离蛋白和核酸（RNA、DNA）第62页，共125页，星期日，2025年，2月5日线性梯度的柱状及板状凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶浓度从上至下直线增加，而孔径则从上到下呈直线降低阶梯式的柱状及板状凝胶电泳浓度和孔径呈有规律的阶梯式变化的凝胶制成的凝胶柱（或板）第63页，共125页，星期日，2025年，2月5日PAGE的基本原理不连续垂直柱状凝胶电泳不连续垂直板状电泳连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第64页，共125页，星期日，2025年，2月5日双向电泳第一维：形成pH梯度进行等电聚焦第二维：SDS凝胶电泳染色：考马斯亮兰染色或银染图像分析：自动扫描第65页，共125页，星期日，2025年，2月5日第四节变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturingPAGE)※非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nativePAGE）在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基磺酸钠（SDS）或者尿素后，用其作为支持物进行凝胶电泳第66页，共125页，星期日，2025年，2月5日SDS是阴离子表面活性剂，与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致基本原理（电荷效应）一、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)第67页，共125页，星期日，2025年，2月5日在强还原剂（如巯基乙醇）存在下，可以打开蛋白质分子内或肽链之间的二硫键，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基排除了蛋白质的电荷和结构差异，SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量所决定。第68页，共125页，星期日，2025年，2月5日主要用途：分离蛋白质蛋白亚基分子质量的测定SDS第69页，共125页，星期日，2025年，2月5日操作过程凝胶的制备：用0.1%SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液配置样品制备：样品溶于1%SDS-0.1%巯基乙醇-0.01mol/L磷酸钠缓冲液电泳条件：电极液（0.1%SDS-0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2）固定与染色：考马斯亮蓝第70页，共125页，星期日，2025年，2月5日第71页，共125页，星期日，2025年，2月5日第72页，共125页，星期日，2025年，2月5日第73页，共125页，星期日，2025年，2月5日第74页，共125页，星期日，2025年，2月5日第75页，共125页，星期日，2025年，2月5日二、尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳用于DNA探针和酶解核酸产物的分离，核酸序列分析等。三、SDS-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分子量﹤10kDa的多肽第76页，共125页，星期日，2025年，2月5日第五节聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)是上世纪60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。第77页，共125页，星期日，2025年，2月5日利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续pH梯度。蛋白质是两性电解质，其pI有差异，电泳时分别聚焦于支持物上pH等于各自pI的区域。IEF第78页，共125页，星期日，2025年，2月5日（一）pH梯度的形成（二）电聚焦分离蛋白质IEF基本原理第79页，共125页，星期日，2025年，2月5日将pK和pI各自相异又相近的两性电解质溶液倾入电泳支持物中，电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的