嗜热毁丝霉6-磷酸果糖激酶-2基因功能研究.pdfVIP

摘要

6--2PFK2/-2,6-FBPase-2

磷酸果糖激酶（）果糖二磷酸酶（）负责可逆地催化果糖

-2,6-二磷酸的合成与降解，存在于几乎所有真核生物中，是调控真核生物糖酵解和糖

异生途径的一个关键酶。然而，该酶在丝状真菌中的功能研究目前研究较少。本研究

选取了工业丝状真菌嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）来源的PFK2/FBPase-2，

对该酶的功能进行了系统研究。

研究结果表明：PFK2/FBPase-2在丝状真菌中由三个基因编码，在嗜热毁丝霉中

pfk2-aMycth_71484pfk2-bMycth_2301421pfk2-cMycth_2312639

分别为（）、（）和（），

PFK2FBPase-2

且三种同工酶均具有和催化结构域。三个基因在不同碳源中均能表达，

且在纤维素、淀粉、纤维二糖为碳源时的表达水平高于葡萄糖、木糖、蔗糖条件时。

体外酶活测定结果表明：PFK2-A具有果糖-2,6-二磷酸酶活性，PFK2-C具有6-磷酸果

糖激酶-2活性，PFK2-B未检测到任何一种活性。体内研究结果表明：过表达pfk2-c

能够促进葡萄糖代谢，而过表达pfk2-a则会抑制菌株生长。随后通过CRISPR/Cas9

系统对三个基因分别进行了单独和组合敲除。结果发现，三个基因均为非必需基因，

同时缺失三个基因导致菌株葡萄糖利用速率降低，而单独敲除pfk2-a后，突变体菌株

葡萄糖利用速率较野生型提高22.15%。代谢组学分析发现∆pfk2-a突变体中心碳代谢

较野生型明显增强，进一步研究发现pfk2-a突变体是通过激活6-磷酸果糖激酶-1

（PFK1）的活性和提高其表达水平，从而促进糖酵解代谢，该结果通过过表达外源

pfk1得到了进一步证实。此外，∆pfk2-a突变体三羧酸循环代谢增强，进而引起了线

粒体电子传递链中交替氧化酶的表达显著增加。最后，本文探究了通过缺失pfk2-a促

进丝状真菌中心碳代谢在代谢工程中应用的可行性，结果表明这一策略能够提高甘油、

苹果酸等代谢产物的产量和合成速率。

本研究首次系统地对丝状真菌PFK2/FBPase-2的功能进行了研究，对全面认识

PFK2/FBPase-2的功能提供了理论基础，同时为提高丝状真菌代谢速率和代谢物产量

提供了有效的改造靶点。

6--2/-2,6-

关键词：磷酸果糖激酶果糖双磷酸酶；丝状真菌；嗜热毁丝霉；糖酵解；代

谢调控；代谢工程

ABSTRACT

6-phosphofructo-2-kinase(PFK2)/fructose-2,6-bisphosphatase(FBPase-2)isakey

enzymethatreversiblycatalyzesthesynthesisanddegradationoffructose-2,6-bisphosphate,

regulatingbothglycolysisandgluconeogenesisineukaryotes.However,itsfunctionsand

mechanismsinfilamentousfungiremainlargelyenigmatic.Inthisstudy,weselected

PFK2/FBPase-2fromanimportantindustrialfilamentousfungusMyceliophthora

thermophilaandsystematicallyinvestigateditsfunction.

OurresultsshowedthatPFK2/FBPase-2isencodedbythreegenesinfilamentous

fungi,namelypfk2-a(Myct