抗真菌肽产生菌的筛选及发酵条件优化.pdfVIP

摘要

摘要

近年，真菌引起的病害日益严重，在食品行业，真菌引起的果蔬腐烂，造成巨

大的损失；在医药行业，抗真菌耐药性现象的出现以及真菌感染率的增加，使得原

有抗生素不再具有杀死致病微生物的能力。开发新型生物抗真菌多肽成为研究的方

向，抗菌肽因无毒副作用、无耐药性，具有天然免疫特性，受到人们的广泛关注。

在发现的抗菌肽中抗真菌肽所占比例较小，活性不高，产量不稳定，且合成成本较

为昂贵，从自然界中筛选获得天然抗真菌多肽用于真菌的防治已经引起人们极大关

注。本论文从土壤样品中分离筛选产抗真菌肽的菌株，并对菌株进行分类鉴定，进

一步研究抗菌肽的抑菌特性，并对其发酵条件进行优化，为该抗菌肽的生产和应用

奠定理论基础和技术支持。主要研究内容如下：

(1)菌株的筛选及鉴定。采用平板稀释法和琼脂扩散法，从河北、江苏等地采

集的土壤样品中筛选具有抑制真菌特性的菌株，以产黄青霉为指示菌进行初筛，以

总状毛霉、黑曲霉和白假丝酵母为指示菌进行复筛，获得一株具有广谱抑菌性的菌

株HD。通过形态学观察、生理生化试验及16SrDNA分子鉴定，该菌株为爱媛类芽

孢杆菌，命名为尸口P，zf6口cf刀螂P办砌P瑚括HD。

(2)抑菌物质的初步鉴定。P幽砌P以s括HD所产抑菌物质经蛋白酶作用，蛋白

酶E作用后抑菌活性完全消失，胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和过氧化氢酶对

抑菌活性影响较小，而蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理后，抑菌活性未发生变化。采用

70％饱和度的硫酸铵进行沉淀，可以将发酵上清液中的抑菌物质完全沉淀，进一步

经过膜透析处理，初步判断尸如砌e瑚西HD所产抑菌物质为小分子多肽类物质。

(3)发酵条件优化。以LB为基础培养基，采用单因素和正交试验优化户

8砌竹es括HD抗菌肽的发酵培养基和培养条件。其最佳发酵条件为：甘露醇2．5

g／L、

鱼蛋白胨103

g／L、MgS04g／L、初始pH7．0、种子接种量2％、摇床转速220印m、

装液量60oC、发酵时间32h。在该条件下，尸P向砌P门5西皿发

n儿、发酵温度32．O

酵上清液抗菌肽效价为324．92AU／mL，与基础培养基相比，产量提高了3．63倍。

(4)抑菌物质稳定性研究。以产黄青霉为指示菌，对户P砌能P咒s括HD抗菌肽稳

定性进行测定。结果表明，户砌砌P凇括HD抗菌肽在4—37oC范围内热稳定性良好，

50．121。C活性减弱。经不同pH处理后，pH6．9之间活性未发生变化，pH1—5和pH

具有较强的耐受力。经化学试剂处理后，甘油可以提高抗菌肽抑菌活性，冰乙酸对

抗菌肽抑菌活性无影响，氯仿使抗菌肽抑菌活性完全消失，异丙醇、乙醇、丙酮、

T

河北科技大学硕士学位论文

乙酸乙酯、三氯甲烷、DMSO、吐温20和丙酮等均降低抗菌肽抑菌活性。

(5)发酵放大研究。在摇瓶发酵的基础上，对5L发酵罐的发酵条件进行优化，

其最佳发酵条件：工业级环糊精103g／L，装

g／L，工业级鱼蛋白胨10g／L，MgS04

L／mill，此条件下P幽f垅P船s括HD

液量50％，接种量5％，转速300印m，通气量9

L发酵罐

抗菌肽效价为371．01AU／mL，比摇瓶最优发酵条件下提高了1．14倍。将5

AU／n止，为实现工业化生产

最佳发酵条件放大到30L发酵罐，抗菌肽效价为364．05

进一步奠定了基础。

关键词爱媛类芽孢杆菌；抗菌肽；菌株筛选；发酵优化；发酵放大

II