分子生物学常用技术及其应用课件.pptVIP

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，猴空泡病毒，逆轉錄病毒）（四）病毒及其他四、重組DNA技術的基本原理克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA重組技術（分子克隆技術、基因工程技術）是指採用分子生物學的方法分離目的基因片段，進行剪切和組合等處理後，與適當的載體DNA分子進行重組，然後將重組體分子引入特定的宿主細胞中進行大量複製和表達的一整套實驗技術。五、重組DNA技術的基本過程基本步驟：製備目的基因和相關載體將目的基因與載體連接將重組的DNA導入受體細胞DNA重組體的篩選和鑒定DNA重組體的擴增、表達和其他研究以質粒為載體的DNA克隆過程目錄一把特殊的剪刀

—限制性內切酶的發現

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學和醫學獎作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）作用：限制-修飾系統第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先後次序。2.命名HindⅢ屬系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶3.Ⅱ類酶識別序列特點——回文結構(palindrome)4.Ⅱ類酶的切割位點：出現兩種末端粘性末端粘端（5’突出、3’突出）平頭末端平端GGATCCCCTAGG4~6bp粘性末端與平頭末端EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-G5’-AATTC-3’3’-CTTAA-5’G-5’Sticky

ends（1）5’突出粘性末端ApaI5’-GGGCCC-3’3’-CCCGGG-5’5’-GGGCC-3’C-3’3’-C3’-CCGGG-5’（2）3’末端突出的粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’（3）平頭末端（鈍性末端）1、DNA連接酶大腸桿菌的DNA連接酶T4噬菌體的DNA連接酶（二）其他工具酶2.DNA聚合酶（1）種類及性質主要有：大腸桿菌DNA聚合酶IT4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶①要求有DNA單鏈為範本和3’-OH的引物鏈②具有5’3’聚合活性、5’3’外切酶活性、和3’5’外切酶活性③要求DNA底物具有5’-磷酸和3’-羥基共同特性：（2）主要用途合成ds-cDNA第二條鏈對DNA的3’端進行填補或末端標記E.coliDNA聚合酶I用於缺口平移，製作DNA標記探針DNA聚合酶I和T4DNA聚合酶用於DNA序列測定TaqDNA聚合酶用於PCR3.逆轉錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA範本、引物、dNTPs）主要用途：①構建cDNA文庫②填補和標記3’端製備DNA探針③DNA序列測定4、多聚核苷酸激酶5’-HOOH-5’5’-PP-5’ATP(γ-P)或RNAP-5’DNA用途：①放射性標記DNA鏈的5