荧光定量技术和常见问题.pptVIP

定量PCR的数学原理第63页，共110页，星期日，2025年，2月5日怎样获得结果首先让我们定义扩增曲线的各种参数。第64页，共110页，星期日，2025年，2月5日PCR的动力学曲线和四个阶段第65页，共110页，星期日，2025年，2月5日指数扩增期重复性准确性动态范围3个阶段中最佳时期第66页，共110页，星期日，2025年，2月5日只有一个扩增期提供高质量的数据指数扩增期第67页，共110页，星期日，2025年，2月5日基线基线（空白）信号的产生是由于背景引起的第68页，共110页，星期日，2025年，2月5日阈值默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10第69页，共110页，星期日，2025年，2月5日怎么获得结果第一步：确定Ct值第70页，共110页，星期日，2025年，2月5日怎么获得结果第二步：比较Ct值第71页，共110页，星期日，2025年，2月5日定量PCR的应用绝对定量相对定量阴阳性鉴定基因分型第72页，共110页，星期日，2025年，2月5日定量PCR实验设计和流程

---绝对定量和相对定量第73页，共110页，星期日，2025年，2月5日定量PCR的实验要素目的基因样品标准曲线标准品监控系统故障阳性对照监控污染阴性对照校准生物学误差内参(管家基因)校准物理误差参比荧光降低随机误差重复实验第74页，共110页，星期日，2025年，2月5日相对定量实验示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1实验目的：样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化？第75页，共110页，星期日，2025年，2月5日实验流程对照样本第76页，共110页，星期日，2025年，2月5日两种相对定量的方法比较Ct（ΔΔCt）法相对标准曲线法样本间目的基因的倍数关系第77页，共110页，星期日，2025年，2月5日两种方法的区别比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法*已知各个基因的扩增效率*每个基因都要做一条标准曲线*不需要每次都做标准曲线*准确的扩增效率计算*简单,经济,通量较高*工作量大,成本高,通量较低第78页，共110页，星期日，2025年，2月5日如何选择相对定量的方法第79页，共110页，星期日，2025年，2月5日如何选择相对定量的方法第80页，共110页，星期日，2025年，2月5日如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表第81页，共110页，星期日，2025年，2月5日如何选择相对定量的方法在EXCEL中制作图表斜率0.1斜率0.1比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法第82页，共110页，星期日，2025年，2月5日ΔΔCt法必要条件：目的基因和内参基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%。第83页，共110页，星期日，2025年，2月5日ΔΔCt法如何确认扩增效率接近100%？每条引物一条标准曲线第84页，共110页，星期日，2025年，2月5日ΔΔCt法标准曲线可以帮助判定扩增效率例如：斜率-3.3说明扩增效率接近100%；更小的负值（如-3.5）说明扩增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1第85页，共110页，星期日，2025年，2月5日ΔΔCt法结果计算步骤一：内参基因均一化样本差异Ct目的基因-Ct目的基因=ΔCt步骤二：处理样本和对照样本作比较ΔCt处理样本-ΔCt对照样本=ΔΔCt步骤三：使用公式计算倍数变化=2-ΔΔCt第86页，共110页，星期日，2025年，2月5日公式含义2-ΔΔCt2=循环间扩增产物量的变化（PCR扩增产物倍增）ΔΔCt=处理样本和对照样本之间校正过大循环数的变化所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化。第87页，共110页，星期日，2025年，2月5日ΔΔCt法计算示例第88页，共110页，星期日，2025年，2月5日