《山羊痘和绵羊痘通用型荧光PCR检测方法》.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA280—2025

山羊痘和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法

DetectionmethodofuniversalfluorescentPCRforgoatpoxvirusandsheeppoxvirus

2025-8-13发布2025-8-13实施

中国兽医协会发布

T/CVMA280—2025

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本标准由中国海关科学技术研究中心提出。

本标准由中国兽医协会归口。

本标准起草单位：中国海关科学技术研究中心、沈阳海关技术中心、河南国际旅行卫生保健中心和大连旅顺文化旅游集团有限公司。

本标准主要起草人：耿庆华、史喜菊、徐超、刘学森、啜微微、李成镛。

T/CVMA280—2025

1

山羊痘和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法。

本文件适用于山羊痘和绵羊痘病毒的检测及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T3186羊冷冻精液生产技术规程

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（Fluorescentpolymerasechainreaction）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）

GPTV：山羊痘病毒（Goatpoxvirus）

SPPV：绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus）

5仪器与设备

5.1荧光PCR检测仪。

5.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。

5.3生物安全柜。

5.4组织研磨器。

5.5普通冰箱。

5.6超低温冰箱：可控温至-70℃。

T/CVMA280—2025

2

5.7可调单道移液器（0.2μL~2μL、1μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL和100μL~1000μL）。

5.8高压灭菌锅。

6试剂和耗材

6.1试剂

6.1.1商品化DNA抽提试剂盒，于4℃~8℃保存。

6.1.2无水乙醇，-20℃预冷。

6.1.375%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。

6.1.48mMNaOH溶液，配制见附录A。

6.1.5PBS缓冲液，0.01mol/LPBS，pH7.4，配制见附录A。

6.1.62×Real-timePCR预混液，-20℃保存，或按照商品化试剂说明书要求保存。

6.1.71.5mL离心管。

6.1.80.2mLPCR薄壁管或八联管。

6.2阳性对照

山羊痘和绵羊痘病毒阳性对照样品：采用商品化山羊痘或绵羊痘病毒疫苗或接种了山羊痘和绵羊痘病毒的细胞悬液或者含有山羊痘和绵羊痘病毒目的基因的核酸（阳性对照核酸序列见附录B）。

6.3阴性对照

山羊痘和绵羊痘病毒阴性对照样品：采用绵羊羔睾丸细胞悬液或健康羊肉组织。

6.4引物和探针序列

引物和TaqMan探针序列见附录C。

7样品采集和处理

7.1采样工具

手术刀、剪刀、镊子，研钵等，经160℃干热灭菌2h。一次性无菌采样拭子，真空采血管，记号笔，低温保藏箱。

7.2样品采集

7.2.1血清样本采集：用无菌注射器抽取受检山羊或绵羊静脉血不少于5mL，置于无菌离心管内，室温或者37℃倾斜放置自然凝集20min~30min，2000r/min~3000r/min离心10min，吸取上清液200μL到新的离心管内备用。

7.2.2精液样品采集：按照NY/T3186的