DB4201_T543-2018_奶牛早期妊娠诊断的荧光定量PCR检测方法_武汉市 .docxVIP

ICS65.020.01

B40 DB4201

武 汉 市 地 方 标 准

DB4201/T543—2018

奶牛早期妊娠诊断的荧光定量PCR检测方法

DB4201/T543-2018

前 言

本规范按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由武汉市农业科学院提出并归口。本标准起草单位：武汉市农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：程蕾、向敏、王定发、胡修忠、刘晓华、余婕、周源、万平民、凌明湖。本规范首次发布。

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奶牛早期妊娠诊断的荧光定量PCR检测方法

1 范围

本标准规定了奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测方法原理、试剂和材料、仪器和设备、测定方法、卫生要求以及废弃物处理。

本标准适用于一级生物安全水平（BSL-1）以上的兽医实验室，用于奶牛人工授精后第18天是否妊娠的诊断性检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

3 术语和定义

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3.5

RSAD2

病毒抑制蛋白。

3.6

RNA

核糖核酸。

3.7

cDNA

互补脱氧核糖核酸。

3.8

bp

碱基对。

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表1 定量PCR引物的序列及参数

目的基因

ISG15

RSAD2

β-Actin

引物序列(5-3)

F:GGTATCCGAGCTGAAGCAGTTR:ACCTCCCTGCTGTCAAGGT

F:GCTGAAAGAAGCAGGTATGGAR:CGTACTTCTGGAACCACCTCT

F:CTGGACTTCGAGCAGGAGATR:GGATGTCGACGTCACACTTC

退火温度(℃)

62

58

58-62

扩增长度(bp)

87

176

208

——荧光定量PCR反应板、封膜

——无RNA酶PCR管（0.2mL、0.5mL和1.5mL）——无RNA酶枪头（10uL、200uL、1000uL）

——一次性手套

6 仪器和设备

仪器和设备包括但不限于：——荧光定量PCR扩增仪；——高速台式冷冻离心机；——普通台式离心机；

——涡旋振荡器；

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7.4.1 牛ISG15、RSAD2基因和内参基因β-Actin荧光定量PCR扩增体系为：2×SYBR?Green10μL，上、下游引物各0.5μL（10μmol/L），cDNA模板0.3μL，ddH2O8.7μL，共20μL；按以上体系向荧光定量PCR96孔反应板依次加入试剂和模板，每个样本重复3次。加样结束后，采用微孔板迷你离心机离心20-30S后放入荧光定量PCR扩增仪。

7.4.2 7.4.2荧光定量PCR反应条件如下：ISG15基因：95°C预变性60s，95°C变性15s，62°C退火15s；72°C延伸30s，共40个循环；RSAD2基因反应条件：95°C预变性60s，95°C变性15s，58°C退火15s；72°C延伸30s，共40个循环；β-Actin基因反应条件：95°C预变性60s，95°C变性15s，62°C或58°C退火15s；72°C延伸30s，共40个循环。

7.5 结果计算与判断

7.5.1 结果计算

a)奶牛早期妊娠诊断依据P值计算公式

P=1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]…..(1)

式中：

X1：人工授精后18天奶牛外周血中ISG15的表达量相对于0天时表达量的倍数X2：人工授精后18天奶牛外周血中RSAD2的表达量相对于0天时表达量的倍数

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9.1 在检验工作流程中，全程对样品的流向及检验进度进行监控：检测科负责人负责安排检测任务分流及下达；各检测室组织检测任务的接收、检测，编制并校对检测原始记录；报告审核人负责检测报告的审核；检测科负责检测样品的管理、检测报告的编制、审核、发放、检测报告副本和原始记录归档管理；样品处理保管员按相关程序对剩余样品进行处理。

9.2 建立样品的唯一性标识，保证样品在检测和保存期间不发生混淆，所有的交接环节要有相关人员签字。

9.3 优先使用国家标准、行业标准、地方标准及农业部规定的检测方法。并定期对技术标准和规范进行收集和查新，对其有效性进行确认。

9.4 样品在检测完毕后，需至少保存6个月。

9.5 建立实验试