尼克酸(维生素PP-又称烟酸)的测定方法.docVIP

尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（1）

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???此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法（分光光度法）

一、微生物法

1.原理

???一种微生物生长必需某一些维生素，Lactobacillusarabinosus的生长需要尼克酸。尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。它是白色晶体，是维生素中最稳定的一种，对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。其检出限为10ng。

2.适用范围

??本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。

3.仪器

（1）电热恒温培养箱(37±0.5℃)

（2）无菌室（紫外灯消毒）

（3）电热手提式压力蒸汽消毒器（121℃，高压30min）

（4）液体快速混合器

（5）离心机（3000转，10min）

（6）碱式滴定管

（7）硬质玻璃试管

4.试剂

所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水

4.1标准溶液的配制

（1）尼克酸标准储备液（0.1mg/ml）：准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。

（2）尼克酸标准中间液（1ug/m）：吸取1.00ml尼克酸标准储备液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。

（3）尼克酸标准工作液（0.1ug/m）：临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混匀。

4.2其它试剂的配制

（1）0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28mlH2SO4，用水稀释至1000ml。

（2）10mol/L氢氧化钠：溶200gNaOH于水中，稀释至500ml。

（3）0.1mol/L氢氧化钠：，取10ml10mol/LNaOH，用水稀释至1000ml。

（4）0.04%溴甲酚绿溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。

（5）酪蛋白（sigma公司）：称取50g不含维生素的酪蛋白，加200ml（3mol/L）盐酸，121℃磅压力下水解6小时，将水解物转移至蒸发皿内，在水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，反复3次，以除去盐酸。

注意：*酸解酪蛋白是为了去除酪蛋白中的维生素，确保培养基中不含代测的尼克酸，但酸解并不一定彻底，因此选用不含维生素的酪蛋白。

*水浴蒸发时不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含营养物已被破坏

用10mol/L氢氧化钠调节PH值至3.5，以溴酚蓝作外指示剂。加20g活性炭，振摇，过滤，反复操作至滤液无色。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯置冰箱中保存。

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尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（2）

（6）溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀释至100ml。

（7）甲苯

（8）4mol/L盐酸溶液，V+V=1+4

（9）5mol/L生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。

（10）胱氨酸、色氨酸溶液：称取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中，加热至70～80℃，逐滴加入20%盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000ml。加少许甲苯于冰箱中保存。

（11）腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤及尿嘧啶各0.1g，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加浓盐酸数滴，再加热。如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止。用水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。

（12）D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液：称取D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg于烧杯中，以水溶解并稀释至1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。

*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中

（13）0.02mol/L醋酸溶液：取1.18ml纯的冰醋酸，稀释至1000ml

（14）核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素结晶于100ml0.01747mol/L的醋酸中，取此

5.4试样的测定：在试管中分别加入1，2，3，4ml样液，加水稀释至5ml，再加入5ml基本培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃）高压10min，冷至室温备用。

5.5接种和培养：每管种一滴接种液，于37±0.5℃恒温箱中培养72小时

*注意：接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。

5.6滴定：从恒温箱中取出后