第12章 免疫组化与荧光原位杂交试剂的研制.pdfVIP

南方医科大学病理学系张庆玲

福州迈新生物技术开发有限公司王小亚

麦克奥迪（厦门）医疗诊断系统有限公司朱晨雁

学习目标与要求

•熟悉免疫组化和荧光原位杂交诊断试剂的研制思路与

问题解决方案。

•掌握免疫组化和荧光原位杂交诊断试剂制备的注意事

项与应用评价。

•了解免疫组化和荧光原位杂交诊断试剂应用原理与临

床意义。

目录

一、免疫组化抗体的研制

二、免疫组化辅助试剂的研发

三、免疫组化自动化染色系统的研发

一、免疫组化抗体的研制

知识点1.单克隆抗体制备方法

•杂交瘤技术（最常见）

•抗体文库筛选

•抗体工程

一、免疫组化抗体的研制

鼠杂交瘤技术制备单克隆抗体流程图

一、免疫组化抗体的研制

知识点2.抗体的测试和鉴定

一般选择Elisa法、免疫印迹法（westernblot，WB）和免

疫组化法。

（1）初步检测

采用Elisa法高通量筛选抗体，如果筛选出的阳性克隆较

多，则选择WB法根据抗体特异性作进一步筛选，筛选出

不超过20个的阳性克隆进行免疫组化检测。

（2）评估验证

特异性敏感性稳定性

一、免疫组化抗体的研制

知识点3.关键技术环节

（1）对照设立：阳性对照与阴性对照。

（2）抗体特性：特异性、敏感性、稳定性和重现性。

（3）人为因素影响：制片因素、试剂质量、染色方法、

染色流程、实验室条件。

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点1.检测放大系统

（1）直接标记法：将酶直接标记在特异性抗体上，使

抗体和检测放大系统结合为一种试剂。

（2）间接标记法

SP法：基于生物素（biotin）与链霉菌抗生物素蛋白（

streptavidin）之间的强亲和力，二抗标记上生物素，即

可与标记了HRP酶的链霉菌抗生物素蛋白相连接。

Polymer法：使用聚合物作为骨架，连接多个抗体和酶

分子。

二、免疫组化辅助试剂的研发

IHC聚合物法原理图

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点2.修复缓冲液

（1）酶修复：对有限的几种抗原有效。

（2）热修复：对大多数抗原都有效。

抗原修复方式比较

抗原修复方式比较

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点3.漂洗缓冲液

具有盐平衡作用，可以保护蛋白质的结构及生物特性，

降低抗体和组织的非特异疏水相互作用。

PBSpH7.5

TBSpH8.4

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点4.封闭液

•将后续试剂同组织中某些物质可能存在结合的位点封

闭，达到减少非特异染色的目的。

（1）同一抗结合的封闭剂

（2）同内源酶结合的封闭剂

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点5.抗体稀释液

在漂洗缓冲液基础上，通常会添加如防腐剂、BSA等其他

试剂，以提高抗体稳定性。

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点6.显色试剂

（1）HRP显色试剂：棕黄色或红色

•DAB：3,3’-二氨基联苯胺

•AEC：3-氨基-9-乙基卡巴唑

（2）AP显色试剂：蓝色或紫蓝色

•BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐

•NBT：四氮唑蓝（nitroblue-tetrazolium）

不同显色试剂对比

不同显色试剂对比

1A:DAB显色；1B:AEC显色；2A:AP-

Red显色；2B:NBT/BCIP显色

二、免疫组化辅助试剂的研发

知识点7.封片剂

使组织标本与空气隔绝，延长标本显色后色泽的保存时

间，同时通过优化折射率便于在显微镜下观察染色结果

（1）水性

（2）非水性：中性树胶

三、免疫组化自动化