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第1页，共18页，星期日，2025年，2月5日目的基因需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系第2页，共18页，星期日，2025年，2月5日目的基因的获得PCR化学合成法cDNA文库基因组DNA文库基因差异表达第3页，共18页，星期日，2025年，2月5日1PCR技术获得目的基因1.1已知序列基因的PCR扩增1.2RT-PCR1.3RACE(cDNA末端的快速扩增)第4页，共18页，星期日，2025年，2月5日1.1已知序列基因的PCR扩增
⑴引物设计；⑵引物效果检验和PCR参数确定。第5页，共18页，星期日，2025年，2月5日1.2RT-PCR原理：利用逆转录酶能将mRNA逆转录成cDNA的特性，通过合适的引物，将细胞内的mRNA逆转录成cDNA。然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。第6页，共18页，星期日，2025年，2月5日逆转录步骤cDNA链合成：一般利用polyT作为引物，也可用特异性的序列作为引物GUAAUCCUCAAAAAAAAAAAAAAAReversetranscriptasemRNAcDNATTAGGAGTTTTTTTTTTTTTTT逆转录polyT引物第7页，共18页，星期日，2025年，2月5日RT-PCR的优点：⑴不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板；⑵单链cDNA合成后其3‘端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核酸，可得到相当于mRNA5’末端的比较完整的序列。第8页，共18页，星期日，2025年，2月5日1.3RACE以mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，然后用PCR技术扩增从某个特定位点到3‘端或到5’端之间的未知核苷酸序列。这里的3‘端和5’端是针对mRAN而言。第9页，共18页，星期日，2025年，2月5日RACE的技术流程⑴分析核心区段经过比对分析，找出同源性较强的序列，然后根据核心序列设计引物。来源：蛋白质、cDNA第10页，共18页，星期日，2025年，2月5日RACE的技术流程⑵设计简并引物和扩增核心区域第11页，共18页，星期日，2025年，2月5日RACE的技术流程⑶设计RACE引物并进行3‘RACE和5’RACE扩增的核心区域克隆和测序后，既获得目的基因中间部分的序列，根据这一序列分别设计RACE引物。3‘RACE：上游引物：根据中间核心序列设计下游引物：oligo（dT）利用cDNA第一链为模板将cDNA3’端扩增出来第12页，共18页，星期日，2025年，2月5日5‘RACE下游引物：根据核心序列设计上游引物：⑴将mRNA5’端的帽子结构切除，然后利用连接酶接上一段已知序列的寡核苷酸；⑵特殊的反转录酶在cDNA末端加碱基；⑶TdT的应用。第13页，共18页，星期日，2025年，2月5日
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