流式细胞仪分析技术及应用 (2).pptVIP

三、免疫胶乳颗粒技术的应用液相芯片技术：利用胶乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和FCM，实现对多种可溶性物质的分析。低样本量、多参数、更高检测效率第62页，共87页，星期日，2025年，2月5日侧向散射光示意图结构复杂程度第30页，共87页，星期日，2025年，2月5日三、荧光测量当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。第31页，共87页，星期日，2025年，2月5日（一）荧光信号测量与放大器线性放大器：输入与输出放大倍数相同，用于信号强度变化较小或具有生物学线性的信号对数放大器：输入放大10倍，输出由1变为2，用于信号强度变化较大且其光谱信号较复杂的信号（二）荧光补偿消除重叠信号第32页，共87页，星期日，2025年，2月5日四、数据显示方式X轴代表一维参数（荧光或散射光信号强度），以通道(channel)表示，其与光强度之间的关系（线性或对数）依放大器的性质而定，通道右侧信号的光强度明显高于左侧，越靠右侧光亮度越强。（一）单参数直方图第33页，共87页，星期日，2025年，2月5日Y轴代表颗粒计数（Count），反映相同荧光或散射光强度的颗粒相对数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。单参数分析只能表达具有相同特性细胞数量与光信号强度的关系，对复杂表型分析时单参数分析结果的准确性会受到诸多因素的干扰。第34页，共87页，星期日，2025年，2月5日双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，X轴与Y轴分别代表一种参数。双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示法是用点密图来显示。如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到两个单参数直方图。临床实践中常以多个散点图联合分析。（二）双参数直方图第35页，共87页，星期日，2025年，2月5日点图由二维参数构成，根据颗粒密度来反映相同光信号的颗粒数量的多少1、点图2、二维等高图等高图(contourplot)是一种可以同时表达两个检测参数和细胞频度的方式，其本质也是双参数直方图第36页，共87页，星期日，2025年，2月5日X轴反映SSC的信号强弱Y轴反映FSC的信号强弱X轴反映FITC荧光信号强弱Y轴反映PE荧光信号强弱点图第37页，共87页，星期日，2025年，2月5日把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多，越密集的区域也就是细胞数目变化最快的区间。等间距等高线适用于细胞数目变化不大的情况对数间距等高线适用于细胞数目变化较大的情况二维等高图第38页，共87页，星期日，2025年，2月5日三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难（三）三参数直方图第39页，共87页，星期日，2025年，2月5日FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计出多种数据。（四）多参数组合分析第40页，共87页，星期日，2025年，2月5日指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。Gate设置2Region设置1指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定要分析的特定细胞群，并要求该样本的所有其他参数组合的直方图只体现该群细胞的分布情况。第41页，共87页，星期日，2025年，2月5日Region设置Gate设置第42页，共87页，星期日，2025年，2月5日五、流式细胞术的特点①速度快对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞②灵敏度高每个细胞上只需带有1000～3000个荧光分子即能检测出来③多参数多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征④精度高在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高⑤纯度高可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到99%以上⑥无害性