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实验双缩脲法测定蛋白质浓度;一、实验目的
1.学习分光光度法测定的原理和方法
2.学习蛋白质含量测定的原理和方法
3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法
;二、原理;2．主要方法：
（1）比较吸收光谱曲线
（2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，
核酸的最大吸收波长为260nm。
;（3）比较吸光度的比值
纯DNA;（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析;
1．原理
Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0
A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL
其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；
K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度
;2．常用方法
（1）标准曲线法
标准曲线与样品的测定条件必须一致。;（2）标准管法
CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。
（3）摩尔吸光系数法
C=A/?（?为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。;四、分光光度计的使用
;1．722型分光光度计的外形;2.仪器操作键介绍
“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式
“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)
“0%T”键：用于自动调整零透射比
“波长设置”旋钮：用于设置分析波长
;3.样品测试操作
①打开电源开关，使仪器预热20分钟
②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上
③打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路
④盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零
⑤取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比
⑥按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)
⑦将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中
⑧打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖
⑨将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
⑩将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。;;;;微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量;Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度;紫外分光光度法测定蛋白质浓度;总蛋白定量分??－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）;?基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。;考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度;CoomassieDye-Based蛋白质定量;（二）双缩脲法测定蛋白质
H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2H2N-CO-NH-CO-NH2＋NH3
双缩脲
双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
本法测定蛋白质范围1-10mg
;三、操作步骤
1.取15支试管，按下表编号、加试剂;谢谢大家！
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