PCR实验常见问题及优化处理方法.pdfVIP

【经验】PCR常见问题汇总

RT-qPCR实验中，大家或多或少会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常和重复性

不好等问题，可从以下几个方面对症分析。

扩增曲线异常

正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值在20-30之间。异常的扩增曲线包括曲

线无平台期、曲线呈锯齿状和Ct值偏大等现象。

1.Ct值偏大（如Ct值＞30）

1）模板量低或表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。

2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过

曲线确认扩增效率。

3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度

不超过300bp。

4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新纯度更

高的模板。

2.扩增曲线无法达到平台期

丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度定量的产品。

3.扩增曲线平台期锯齿状

1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新高纯度RNA

重新实验。

2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

【Experience】AsummaryofPCR

FAQs

InRT-qPCRexperiments,everyonewillmoreorsencounterproblemssuchasabnormal

amplificationcurves,abnormalmeltingcurves,andpoorreproducibility,whichcanbe

analyzedsymptomaticallyfromthefollowingaspects.

Abnormal

amplificationcurve

ThenormalamplificationcurveisgenerallyS-shaped,andtheCtvalueispreferablyween

20-30.Theabnormalamplificationcurveincludesthephenomenonofnostageofthecurve,t

hezigzagshape,andtheCtvalueistoolarge.

1.TheCtvalueistoolarge(suchasCt

value＞30)

1)Ifthetemtequantityisloworthegeneexpressionabundanceislow,itisrecommendedto

increasethetemtequantitytoobservewhethertheCtvaluecanbereducedina

correspondingfold.2)IftheentirereactionconditionsofqPCRarenotsuitableortheprimer

designisimproper,itisrecommendedtoconfirmtheamplificationefficiencythroughstandard

curves.3)Theamplificationproductistoolong.Itisrecommendedtouseathree-stepprocedure

toamplifyoroptimizeprimers.Thelengthoftheamplificationproductshouldnotexceed300bp.

4)Theremaybeinhibitorsinthesystemthat