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泰安地区鸡源大肠杆菌病的病原分离、鉴定及耐药性分析

摘要

本研究旨在对泰安地区鸡源大肠杆菌病进行病原分离、鉴定，并分析其耐药性。通过采集泰安地区发病鸡的病料样本，运用细菌分离培养技术进行大肠杆菌的分离，结合形态学观察、生理生化试验以及16SrRNA基因序列分析对分离菌株进行鉴定。采用药敏纸片扩散法（K-B法）测定分离菌株对18种常用抗菌药物的敏感性。结果成功从病鸡样本中分离出38株大肠杆菌，经鉴定均为致病性大肠杆菌。耐药性分析显示，分离菌株对多种抗菌药物呈现较高耐药率，其中对氨苄西林、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶的耐药率分别高达89.5%和86.8%，多重耐药现象普遍存在。本研究结果为泰安地区鸡源大肠杆菌病的科学防控及合理用药提供了重要参考依据。

关键词

泰安地区；鸡源大肠杆菌病；病原分离；鉴定；耐药性

一、引言

大肠杆菌（Escherichiacoli）是一种广泛存在于自然界和动物肠道内的革兰氏阴性菌，多数情况下为非致病性共生菌，但其中一些血清型可引发动物和人类的疾病，是鸡大肠杆菌病的主要病原菌[1]。鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种常见的细菌性传染病，可导致鸡出现败血症、气囊炎、输卵管炎、脐炎等多种病症，给养鸡业带来严重的经济损失[2]。

泰安地区作为山东省重要的养鸡产区，养鸡业在当地农业经济中占据重要地位。然而，随着养鸡规模的不断扩大，鸡大肠杆菌病的发生愈发频繁，严重制约了养鸡业的健康发展。目前，抗生素在鸡大肠杆菌病的防治中仍被广泛应用，但由于抗生素的不合理使用，导致大肠杆菌耐药性问题日益严重，使得临床治疗效果不佳，治疗成本增加[3]。因此，开展泰安地区鸡源大肠杆菌病的病原分离、鉴定及耐药性分析，对于了解该地区鸡源大肠杆菌的流行特点和耐药现状，制定科学合理的防控措施，减少抗生素的滥用具有重要意义。

二、材料与方法

2.1材料

2.1.1病料来源

于2023年1月-2024年12月期间，从泰安地区不同规模的养鸡场采集具有典型大肠杆菌病症状（如精神萎靡、呼吸困难、腹泻等）的病鸡或病死鸡，共采集病料样本120份，包括肝脏、心脏、气囊等组织。

2.1.2主要试剂与仪器

LB培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×TaqPCRMasterMix购自宝生物工程（大连）有限公司；18种药敏纸片（氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、头孢曲松、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、强力霉素、四环素、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、复方新诺明、痢菌净、痢特灵）购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

主要仪器包括恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、PCR仪（杭州博日科技股份有限公司）、凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）等。

2.2方法

2.2.1病原菌的分离培养

将采集的病料样本在无菌条件下剪碎，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养18-24h。然后用接种环取培养液划线接种于麦康凯培养基和伊红美蓝培养基，37℃培养18-24h，观察菌落形态。挑取疑似大肠杆菌的菌落（麦康凯培养基上呈红色、湿润、光滑的菌落；伊红美蓝培养基上呈紫黑色、有金属光泽的菌落），在营养琼脂培养基上进行纯化培养，获得纯培养物，4℃保存备用。

2.2.2形态学观察

将纯化后的菌株进行革兰氏染色，在油镜下观察细菌的形态、大小和染色特性。

2.2.3生理生化试验

参照《伯杰氏系统细菌学手册》[4]，对纯化后的菌株进行生理生化试验，包括糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、吲哚试验、甲基红试验、VP试验、柠檬酸盐利用试验等。

2.2.416SrRNA基因序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA。以提取的DNA为模板，利用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性产物送至上海生工生物工程股份有限公