细胞冷冻保存操作与事项.pdfVIP

细胞冷冻保存

１．材料：

1)新鲜培养基

2)二甲基亚砜（DMSO）

3)无菌塑料冷冻保存管

4)-20℃冰箱

5)-80℃冰箱

6)程序降温机(可有或无)

２．步骤：

1)冷冻前应注意细胞生长情形，可一日更换半量或全量培养基。

2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，使其最终浓度为5~10％，混合均

匀，置于室温下备用。

3)按照细胞传代培养操作规程收集细胞，并取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率。

4)将收集之细胞离心1000rpm、5分钟后，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，混合均匀后，使细

胞浓度为1~5x106cells/ml，分装至冷冻保存管中，每管分装1ml。

5)冷冻保存方法1：冷冻管置于4℃、10~30分钟?移至-20℃、30分钟**?移至-80℃、16～18小

时（或隔夜）?移至液氮罐中长期。

6)冷冻保存方法2：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中，以每分钟降1~3℃速率降至-80℃以下，

然后放入液氮槽之vaporphase长期。

注意事项：

1)欲冷冻保存的细胞应处于对数生长期，汇合率约为80～90％。

2)冷冻前应检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤细胞应在冷冻保存前一至二日测试是否可以

产生抗体。

3)一般冷冻保护剂为5~10%DMSO。应注意冷冻保护剂的品质，DMSO应为组织培养级，无色且无菌

﹙以0.22μｍ滤膜过滤或是直接无菌产品﹚。若为大体积包装，将其以少量分装，4℃避光保

存，避免反复冻融。

Cell

cryopreservation

1.Materials:

1)Freshculture

2)Dimethylsulfoxide

(DMSO)3)Sterilestic

cryopreservationtube4)-

20°Crefrigerator5)-80°

Crefrigerator6)

Progrblecooling

machine(optionalornot)

2.Steps:

1)Payattentiontocellgrowthbeforefreezing,andrecehalforthefullamountofculture

thedaybefore.2)Preparecryopreservationsolution(preparebeforeuse):Add

DMSOtofreshculturetoafinalconcentrationof5~10%,mixevenly,andceat

roomtemperatureforlateruse.3)Collectcellsaccordingtothecellsubcultureoperating

procedures,andtakeasmallamountofcellsuspensiontocountthecellconcentrationand

survivalratebeforefreezing.4)Centrifugethecollectedcellsat1000rpmfor5m