TSHAIA 002— 2024胎牛血清中碱性磷酸酶的测定荧光分光光度法.docxVIP

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胎牛血清中碱性磷酸酶的测定荧光分光光度法

DeterminationofalkalinephosphataseinfetalbovineserumFluorescencespectrometry

2025-05-01发布 2025-08-01实施

上海市分析测试协会 发布

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前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由上海市分析测试协会提出。本文件由上海市分析测试协会归口。

本文件起草单位：华东理工大学、中科沃业江苏生物有限公司、上海化工研究院有限公司、月旭科技（上海）股份有限公司、上海沃凯生物技术有限公司

本文件主要起草人：张磊，于博昊，孙旭东，徐磊，赵雅梦，栾建明，任兴发，凌芳，张维冰

胎牛血清中碱性磷酸酶的测定荧光分光光度法

警示——本文件规定的一些试验过程可能导致危险情况，使用者有责任采取适当的安全和健康措施。

范围

本文件规定了胎牛血清中碱性磷酸酶物质含量的荧光分光光度测定方法。本文件适用于胎牛血清中碱性磷酸酶的检测，测定范围0.10～20U/L。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

术语和定义

活性：生物酶活性表示其催化反应的酶活力。

原理

基于稀土/核苷酸配位聚合物独特的光学性质以及固有良好的生物相容性，制备得到荧光检测试剂CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris。荧光试剂在295nm的激发波长下，产生363nm和435nm的荧光信号，当荧光试剂加入碱性磷酸酶（ALP），进行孵育后，363nm处荧光猝灭，435nm处荧光保持稳定，通过荧光强度I435/I363的比值测定ALP的含量。

仪器设备

荧光分光光度计：激发波长220nm~730nm；发射波长220nm~900nm。 分析天平：分度值0.01mg和0.1mg。

pH计：精度±0.05。

离心机：离心力≥8000g。

恒温水浴锅：控温精度（37±0.5）℃。

试剂和材料

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为符合GB/T6682分析实验室用水要求。

硝酸铈，分析纯。

正硅酸乙酯（TEOS），分析纯。

无水乙醇，分析纯。

浓氨水（25%质量分数）。 三磷酸腺苷（ATP）。

三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 环丙沙星（CIP）。

分析步骤

荧光检测试剂CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris的制备

取环丙沙星（6.7）溶于无水乙醇，去离子水，浓氨水（160mL：40mL:1.5mL）的混合溶液中，得到50molL-1的混合溶液，室温下超声30min，得到透明状液体。然后逐滴加入0.4mL正硅酸乙酯，25℃下机械搅拌12h。反应结束后，在室温条件下，以7500rpm离心15min收集，依次用无水乙醇和去离子水洗涤，得到CIP@SiO2试剂，用3mL去离子水超声分散，收集下层固体，待用。

配置0.25molL-1的硝酸铈水溶液和0.125molL-1的ATP的Tris-HCl溶液（50mM，pH=7.1）,取2mLCIP@SiO2分散液，磁力搅拌下加入8.3mLATP溶液，搅拌5min后逐滴加入16.7mL硝酸铈水溶液室温下继续搅拌60min。在室温条件下，以7500rpm离心15min收集，弃去上清液，用去离子水洗

涤6次，用3mL去离子水分散。待用。

碱性磷酸酶ALP标准溶液的配制及标准曲线的建立

分别量取7.1中荧光检测试剂溶液于13组5mL离心管中，分别加入100μL不同浓度的ALP溶液，ALP浓度依次为0、0.4、0.8、1、1.5、2、4、6、8、10、12、15、20U/L，然后分别滴加浓度为50mM、pH=7.1的Tris-HCl缓冲溶液至3mL，在恒温水浴锅37℃孵育60min，在激发波长为295nm，发射波长为363nm和435