乳酸克鲁维酵母CRISPR-Cas9基因编辑平台的构建及其在凝乳酶高效表达中的应用.pdfVIP

摘要

乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）是一种典型的非常规酵母，其具有

高生长速率、高蛋白产量、食品级安全微生物、发酵成本低、可以利用的碳源

极广（尤其是可以分解利用乳糖为唯一碳源进行生长）等多种优势，因此已经

成为合成生物学研究中极具潜力的底盘菌株。但是相比于其他宿主系统，

K.lactis的基因编辑工具相对较少，限制了对其基因组的精确操控和改造。本研

究旨在该酵母中构建CRISPR-Cas9基因编辑平台并利用此平台精准改造宿主

K.lactis，得到高分泌菌株，并且利用重组牛凝乳酶基因作为目标蛋白，得到高

产、高活的重组牛凝乳酶菌株，为后续K.lactis的表达系统应用于工业规模生产

重组牛凝乳酶提供引导以及为微生物高效表达异源蛋白提供新的菌种来源。论

文主要研究内容如下：

（1）外源性启动子的筛选：通过酿酒酵母基因组序列获得了6种组成型启

动子序列。以人工合成的酵母增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因，通

过各启动子驱动表达EGFP鉴定不同启动子的转录活性，最终获得了6种强度

不同的启动子序列。其中，ADH1和PGK1在K.lactis的游离质粒上具有最高转

录活性。

（2）利用构建的K.lactis内的CRISPR-Cas9基因组编辑平台，针对K.lactis

的基因组进行了精准的基因编辑。通过敲除抑制因子pmr1，成功地调控了

K.lactis的细胞功能，得到高分泌K.lactis菌株；通过敲除ku80基因，成功的获

得了一个能够用来进行高效精准基因编辑的菌株，此菌株同样适用于传统的同

源重组。在此菌株中靶向pmr1的基因敲除效率达到100%，利用ku80和pmr1

双基因缺失的菌株去重组生产凝乳酶，最终得到一个基于LAC4位点生产牛凝

乳酶的高效重组K.lactis菌株，酶活性最高能够达到3073.4SU/mL。

（3）为避免LAC4位点多个串联表达框所带来的基因组不稳定和同源序列

之间相互重组所带来的基因组缺失的风险。通过CRISPR-Cas9将PGK1启动子

驱动的牛凝乳酶表达框插入到不同染色体的不同位点。最终得到一株稳定的适

合发酵的高产牛凝乳酶菌株CP3i（Δku80::PEC，Δpmr1::PEC，Δhap1::PEC），

酶活力达到1200SU/mL。

本研究为K.lactis中异源蛋白表达提供了两种途径。一种是利用pKLAC1载

体进行整合表达，然后通过敲除抑制因子来增强异源蛋白的分泌。另一种是将

蛋白表达框整合到不同染色体的不同位点上，从而得到稳定表达蛋白的菌株。

这些实验结果为后续的菌株改造提供了坚实的实验基础。

关键词：乳酸克鲁维酵母；CRISPR-Cas9；基因编辑；重组小牛凝乳酶

ABSTRACT

Kluyveromyceslactis,atypicalunconventionalyeast,isgainingprominencein

syntheticbiologyresearchduetoitsnumerousadvantages,includingrapidgrowth,

high-yieldproteinproduction,food-gradesafety,lowfermentationcosts,andthe

abilitytoutilizeawiderangeofcarbonsources—particularlylactoseasthesole

carbonsourceforgrowth.However,comparedtootherhostsystems,K.lactislacks

well-establishedgeneeditingtools,whichrestrictsprec