蛋白质的结构.pptVIP

第1页，共27页，星期日，2025年，2月5日化学组成法测定最低分子量SDS法凝胶过滤法渗透压法扩散系数法沉降系数法和沉降平衡法2蛋白质的分子量大小测定第2页，共27页，星期日，2025年，2月5日如肌红蛋白含0.335%的铁，Fe分子量55.8最小M＝×100＝×100＝16700Fe分子量Fe(%)55.80.3351）根据分子组成测定最低分子量血红蛋白含0.335%的铁，Fe分子量55.8血红蛋白的实际分子量是66800（＝16700×4）第3页，共27页，星期日，2025年，2月5日2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）带电物质在电场中迁移的速度受什么影响？电荷多少分子大小形状加入SDS和巯基乙醇？第4页，共27页，星期日，2025年，2月5日SDS（十二烷基硫酸钠）－－－sodiumdodecylsulfate第5页，共27页，星期日，2025年，2月5日使用去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。第6页，共27页，星期日，2025年，2月5日SDS是一种阴离子去污剂，带有很多负电荷。与蛋白质结合以后，使蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了。SDS是一种变性剂，与蛋白质结合，改变了蛋白质单体分子的形状，均变成长椭圆棒状。所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。第7页，共27页，星期日，2025年，2月5日第8页，共27页，星期日，2025年，2月5日注意：SDS－PAGE是将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。第9页，共27页，星期日，2025年，2月5日3）沉降分析法沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。沉降常数（沉降系数）：当沉降界面以恒速移动时，单位离心场中的沉降速度。S：沉降常数v：沉降速度（cm/sec）w：离心机转头的角速度（弧度/sec）x：蛋白质界面中点离旋转中心的距离，以cm计。第10页，共27页，星期日，2025年，2月5日沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析。蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度氯化铯密度剃度离心第11页，共27页，星期日，2025年，2月5日沉降系数:把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或沉降系数单位，用S（大写）表示。瑞典的蛋白质化学家T.Svedberg1S=10-13第12页，共27页，星期日，2025年，2月5日M=——————RTSD（1－Vρ）R——气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——绝对温度D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V——蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1）S——沉降系数蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系第13页，共27页，星期日，2025年，2月5日3．等电点的测定第14页，共27页，星期日，2025年，2月5日4．生物活性的测定不同的蛋白质有不同的生物功能，也就有不同的生物活性测定的方法。第15页，共27页，星期日，2025年，2月5日（六）含量测定总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。特定蛋白组分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示其它蛋白：抗原抗体反应(westernblot)第16页，共27页，星期日，2025年，2月5日说明双向电泳分离蛋白质的技术原理及其在蛋白质组学研究中的重要意义西北大学05年双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）

如果将等电聚焦电泳与SDS结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了。双向电泳后的凝胶经染色，蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差