聚合酶链式反应 (2).pptVIP

2．模板PCR反应的模板可以是单链分子、双链分子、线状分子或环状分子，可以是DNA，也可以是RNA。(线状分子比环状扩增的效果稍好)。当用RNA作模板时．首先要先进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。模板来源较广泛，可以从培养的细胞、细菌、病毒和组织中等提取，也可从收集的病理样品和考古标本等获得。?模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102-105个拷贝。过多可能会增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。第29页，共82页，星期日，2025年，2月5日3．引物引物可以决定PCR扩增产物的特异性与长度。PCR有两种引物，即5’端引物与3’端引物，是一种寡核苷酸片段，分别与模板5‘端序列和3’端序列互补。引物设计的一般原则：(1)引物长度：引物不宜太短或太长，一般以16-36bP为宜，引物太短会影响PCR的特异性，引物过长会增加成本和引物的Tm值，Tm值如果超过TaqDNA聚合酶的最适延伸温度，也会明显影响产物的特异性。(2)G+C含量：引物中G+C含量一般40％—60％为宜。第30页，共82页，星期日，2025年，2月5日(3)碱基分布：4种碱基应随机分布，嘌呤或嘧啶不要有3个以上连续排列。尤其是在引物3端，否则会形成引物与核酸G(或C)富集区之间的错误互补，影响PCR的特异性。(4)引物自身不含互补序列。(5)两个引物之间的互补或同源碱基应＜4个。(6)引物与非特异性靶区之间的同源性要＜70％或者连续互补同源碱基＜8。(7)引物3’端不能错配。3’端最好是G或C，切忌A。(8)引物5’可以修饰，包括增加酶切位点、用生物素、荧光物质、地高辛等标记，以及引入突变位点、启动于序列和蛋自质结合DNA序列等。★一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。第31页，共82页，星期日，2025年，2月5日4．底物dNTP为PCR合成DNA的底物，各种dNTP浓度相同，一般浓度为20—200umol／L。第32页，共82页，星期日，2025年，2月5日5．缓冲液根据经验，一个50—100ul的标准反应系统，应包括20umol/LTris-Hcl缓冲液(PH7.5)、100mmol/LKCI、1mmol/LDTT、0.1mmol/LEDTA、0.5％Tween20和1.5mmol/LMgCl2。Tris—HCl缓冲液可稳定pH值，Kcl有利于引物退火，而DTT与Tween20，则可以保护Taq聚合酶的催化活性。在PCR反应系统中应加入Mg2+，因为Taq聚合酶活性需要Mg2+，但该离子浓度变化亦不能过低或过高，过低时酶活性降低，而过高会催化非特异性扩增，且酶活性还会受到抑制。此外，Mg2+的浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等过程。第33页，共82页，星期日，2025年，2月5日二、反应过程及条件1．变性PCR扩增循环变性的温度和时间分别为95℃、30s，或97℃、15s。提高变性温度可以使变性时间缩短，但温度过高或时间过长会破坏Taq聚合酶及dNTP。一般选择温度为94℃或95℃，时间为30—60s。第34页，共82页，星期日，2025年，2月5日2．复性变性结束后，DNA快速冷却，以便模板与引物转到复性(即退火)步骤。复性温度过高，融合率低，甚至为零。温度太低，则会增加非特异性结合。复件温度可根据引物长度及其G＋C含量来确定，引物长度在15—25bp之间，Tm(解链温度)值可以按公式：4(G＋C)＋2(A＋T)来计算，引物过长，Tm值会偏高。实际操作中，复性温度可以比Tm值低6℃—8℃为宜。第35页，共82页，星期日，2025年，2月5日3．延伸Taq聚合酶的最适温度在70℃—75℃之间。延伸步骤的温度—般选择72℃左右，这时Taq聚合酶的延伸速度为35－100个核苷酸/s。延伸时间的选择可参考下表。在扩增的产物中若存在大量的二级结构时，应加长延伸时间。第36页，共82页，星期日，2025年，2月5日4．循环次数循环次数主要取决于初始模板或靶分子的浓度，但循环次数不可以无限地增加，因循环次数过多会导致非特异性产物及增加碱基错配率。经过若干次循环，酶的活性、dNTP与引物的浓度会逐渐降低，这些因素都会使PCR产物逐渐停止指数增长状态，进而转变到线性或静止增长状态，后一种状态称为平台