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PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（实验指南）

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中验证PCR扩增效果、鉴定产物大小与纯度的核心技术，广泛应用于基因克隆、核酸检测、分子诊断等领域。本指南基于《分子克隆实验指南》（第四版）及常规实验室操作规范，系统梳理实验原理、操作流程、结果判读及注意事项，确保实验准确性与可重复性。

一、实验原理

琼脂糖凝胶电泳利用核酸分子的电荷效应与分子筛效应实现分离：

电荷效应：PCR产物（DNA）带负电荷，在电场作用下向正极（阳极）移动，迁移速度与分子所带电荷成正比（因DNA电荷密度均匀，此因素影响较小）；

分子筛效应：琼脂糖凝胶形成多孔网状结构，DNA分子在凝胶中迁移时，小分子片段（如100bp）可快速穿过凝胶孔隙，大分子片段（如1000bp）迁移受阻，最终按分子量大小在凝胶中形成不同条带，通过与已知分子量的DNAMarker（标准参照物）对比，可确定PCR产物的实际大小。

此外，凝胶中加入的溴化乙锭（EB）或SYBRGreenI等荧光染料，可嵌入DNA双链沟槽中，在紫外灯下发出橙红色荧光，实现PCR产物的可视化检测。

二、实验材料与试剂准备

2.1核心材料

PCR扩增产物（体积通常为10-20μL，浓度建议≥50ng/μL）；

DNAMarker（根据预期产物大小选择，如100bpLadder、500bpLadder，常用浓度100ng/μL）；

琼脂糖（电泳级，纯度≥99%，避免杂质影响电泳效果）；

电泳缓冲液（常用1×TAE或1×TBE，需提前配制并灭菌）；

上样缓冲液（6×LoadingBuffer，含溴酚蓝、二甲苯青等指示剂，用于标记电泳前沿，常用配方：0.25%溴酚蓝+0.25%二甲苯青+40%蔗糖水溶液）；

荧光染料（如10mg/mLEB溶液，或1000×SYBRGreenI，注意EB为强致癌剂，需戴手套操作）；

去离子水（无酶无核酸污染，避免降解PCR产物）。

2.2实验仪器

电泳槽（含梳子，梳子齿数根据样品数量选择，常用10齿、15齿）；

电泳仪（电压范围0-300V，电流范围0-100mA，需定期校准）；

凝胶成像系统（配备紫外灯，波长254nm或302nm，用于条带观察与拍照）；

电子天平（精度0.01g，用于称量琼脂糖）；

微波炉或电磁炉（用于加热溶解琼脂糖）；

移液器（10μL、20μL、100μL，需提前灭菌并校准量程）；

离心管（1.5mL无酶离心管，用于混合样品与上样缓冲液）。

三、实验操作步骤（标准流程）

3.1琼脂糖凝胶的制备（以1%凝胶为例，适配50-1000bp产物分离）

计算试剂用量：根据电泳槽大小确定凝胶体积（如小型电泳槽需50mL凝胶），按浓度公式计算琼脂糖质量：

琼脂糖质量（g）=凝胶浓度（%）×凝胶体积（mL）/100

示例：50mL1%凝胶需琼脂糖0.5g；若需分离2000bp以上大分子产物，可降低浓度至0.8%（50mL需0.4g）；分离50bp以下小分子产物，需提高浓度至2%（50mL需1.0g）。

溶解琼脂糖：将称量好的琼脂糖放入三角烧瓶，加入50mL1×TAE缓冲液，轻轻摇匀后放入微波炉，中高火加热2-3分钟（中途暂停摇匀1次，避免局部过热暴沸），直至琼脂糖完全溶解（溶液澄清透明，无颗粒）。

加入荧光染料：待凝胶溶液冷却至50-60℃（手感不烫手），加入荧光染料（EB终浓度0.5μg/mL，即50mL凝胶加2.5μL10mg/mLEB；SYBRGreenI终浓度1×，即50mL凝胶加50μL1000×染料），轻轻摇匀（避免产生气泡）。

倒胶与插梳：将电泳槽水平放置，倒入凝胶溶液，厚度控制在3-5mm（约覆盖梳子齿尖1-2mm），立即插入梳子（梳子底部距电泳槽底部1-2mm，避免漏液），室温静置30-40分钟，待凝胶完全凝固（呈乳白色不透明状）。

组装电泳系统：小心拔出梳子（避免撕裂凝胶孔），将凝胶放入电泳槽，加入1×TAE缓冲液，液面需没过凝胶表面1-2mm（若液面过低，凝胶易干燥；过高则电流过大，条带扩散）。

3.2样品制备与上样

样品混合：取1.5mL离心管，按“PCR产物8μL+6×LoadingBuffer2μL”的比例混合（总体积10μL，可根据产物浓度调整，上样量建议50-100ng），轻轻吹吸混匀（避免产生气泡），若有气泡需短暂离心（1000rpm，10秒）去除。

上样操作：将移液器调至10μL，吸取混合好的样品，缓慢伸入凝胶孔上方（避免移液器枪头触碰凝胶孔边缘导致孔