免疫学检验免疫原和抗血清的制备87课件.pptxVIP

免疫学检验;;目录;抗原和抗体是免疫学检测中的两大基本因素，抗原的纯化是制备特异性抗体的先决条件，制得的抗体又可用于抗原的纯化和检测。

;免疫原（immunogen）就是抗原，是指能够刺激机体产生抗体并能与之发生特异性反应的物质。众多的抗原物质中绝少是单一组分的，所以必须从复杂的物质中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。(颗粒性、可溶性）

;颗粒性抗原主要包括人和动物细胞抗原、细菌抗原和寄生虫抗原等，他们的免疫原性强，制备方法比较简单。;采集新鲜绵羊红细胞注入无菌并带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动15分钟后除去纤维蛋白，再以无菌生理盐水洗涤3次，最后配成1×106/ml浓度的细胞悬液，即可应用。

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细菌抗原有菌体抗原和鞭毛抗原等，多选用典型菌株的液体或固体培养物经集菌后处理。鞭毛抗原需用有动力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理，而菌体抗原则需要在100℃加温2～2.5小时后应用。

;蛋白质（细菌毒素、酶）多糖、核酸等皆为可溶性抗原，这些物质大多来源于人和动物的组织和细胞，要想获得此类抗原，通常要先破碎组织和细胞，再进一步提取和纯化。;1.组织匀浆的制备

;⑴反复冻融法

⑵超声破碎法

⑶溶菌酶处理法

⑷自溶法

⑸表面活性剂处理法;1.超速离心法（不同密度）

(1)差速离心法:是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中大小差别较大组分的分离。;1.超速离心法

(2)密度梯度离心法:利用各颗粒在梯度介质中的

沉降速率不同，使具有不同沉降速率的颗粒处于

不同密度梯度层内，从而达到分离的目的。;盐析沉淀法：蛋白质在稀盐溶液中，其溶

解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐

溶。但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶

解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，

此种现象被称为盐析。（利用各种蛋白质在不

同盐浓度中有不同的溶解度）

;盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。

;凝胶过滤层析:也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。;利用一些带离子基团的纤维素或凝胶吸附交换带有相反电荷的蛋白质抗原。（电荷不同）;5.亲和层析

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。;6.电泳法

各种蛋白质在同一酸碱度的条件下分子量和电荷量不同导致其在电场中的迁移速率不同，从而得以分离。;纯化抗原的鉴定内容包括含量、分子量、纯度和免疫活性的鉴定等。鉴定方法较多，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、酶联免疫吸附试验、免疫电泳法、双向琼脂扩散试验等。;用化学合成法或基因重组法制备的抗原，称之为人工抗原，包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。;半抗原不能直接做为免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后，才具有免疫原性。这种经过人工修饰的半抗原称之为人工结合抗原，用于偶联半抗原的大分子物质称为载体。;1.常用的载体;2.半抗原与载体的连接;3.人工结合免疫原的鉴定;用化学方法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽，即人工合成抗原。

同聚多肽：由一种氨基酸形成的聚合体。

共聚多肽：由两种或两种以上氨基酸形成的聚合体。

;将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体DNA分子相结合，然后引入受体细胞中（如大肠杆菌或酵母菌）使之表达，能获得免疫原性之融合蛋白，经纯化后可作为抗原，即基因工程抗原。;;在进行动物免疫时最常用的佐剂是福氏（Freund）佐剂，根据有无卡介苗又可分为福氏不完全佐剂和福氏完全佐剂。福氏不完全佐剂是由油剂和乳化剂制成，在福氏不完全佐剂中加入卡介苗就成了福氏完全佐剂。;福氏佐剂和抗原的比例为1:1。由于福氏佐剂

是油剂，加入抗原后要充分混合成乳