酵母双杂交(自激活).pptVIP

第1页，共15页，星期日，2025年，2月5日真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。一、原理酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。第2页，共15页，星期日，2025年，2月5日GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合。AD则能激活UAS下游的基因进行转录。单独的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。第3页，共15页，星期日，2025年，2月5日第4页，共15页，星期日，2025年，2月5日第5页，共15页，星期日，2025年，2月5日His,β-gal第6页，共15页，星期日，2025年，2月5日一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的BD单独与UAS结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。第7页，共15页，星期日，2025年，2月5日His,β-gal自激活原理TranscriptionfactorsGAL4BD第8页，共15页，星期日，2025年，2月5日YPDA液体500ml固体100ml蛋白胨10g2g酵母提取物5g1g琼脂——2g0.2%ade10ml2ml葡萄糖10g2gYPDA培养基0.2gade定容至100ml→0.2%的ade母液pH6.5灭菌121℃15min第9页，共15页，星期日，2025年，2月5日正对照：pGAL4负对照：pBD-GAL4第10页，共15页，星期日，2025年，2月5日将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5mlYPAD液体培养基中，剧烈震荡5min，打散菌落，接种于50mlYPAD液体培养基中（250ml三角瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到，换单克隆重摇。取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃，230rpm，摇培3hr，至OD600值为0.4~0.6。4000rpm5min于常温收集菌体，重复一次。室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml超纯水清洗悬浮3次。1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml1×TE/LiAc重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。（只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。酵母菌株感受态细胞制备：第11页，共15页，星期日，2025年，2月5日Fortheyeasttwo-hybridmethodwealsohaveacoupleofgeneconstructsnecessary..consturctsinyeastexpressionvectorssowhentheycomeintotheyeasttheyareexpressed.ThefirstconstructistheDNAbindingdomainofthetranscriptionactivatorcoupledtoDNAcodingforourproteinX.Whenthisgenecomestoexpressionwegetahybridprotein…XplusDNAbindingdomain.ThesecondgeneconstructistheactivatordomaincoupledtoDNAcodingforproteinY.Whenthisgenecomestoexpressionwegetanotherhybridprotein..Yplustheactivatordomain.Thusthename“two-hybrid”.Nowthequestion: