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单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶系统的构建与调控因子研究

目录

内容简述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4

1.1研究背景与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4

1.1.1单增李斯特菌的研究现状．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7

1.1.2谷胱甘肽过氧化物酶的功能与重要性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8

1.1.3本研究的理论意义与实践价值．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10

1.2国内外研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

1.2.1单增李斯特菌氧化应激研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14

1.2.2谷胱甘肽过氧化物酶研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17

1.2.3微生物酶系统构建与调控研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19

1.3研究内容与目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20

1.3.1研究内容．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21

1.3.2研究目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22

1.4技术路线与研究方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26

1.4.1技术路线．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27

1.4.2研究方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30

材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31

2.1实验材料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34

2.2实验方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38

2.2.1菌株培养与保存．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41

2.2.2基因克隆与重组质粒构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．43

2.2.3基因表达调控载体构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．45

2.2.4基因敲除与互补．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46

2.2.5谷胱甘肽过氧化物酶活性测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．48

2.2.6谷胱甘肽过氧化物酶基因表达分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50

2.2.7细胞生物学分析方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．53

2.2.8数据统计分析方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．55

单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶系统构建．．．．．．．．．．．．．．．．．58

3.1单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶基因的鉴定与分析．．．．．．．．61

3.1.1谷胱甘肽过氧化物酶基因的序列分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63

3.1.2谷胱甘肽过氧化物酶基因的保守性分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．65

3.2单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶重组表达载体的构建．．．．．．67

3.2.1表达载体的选择与改造．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．69

3.2.2谷胱甘肽过氧化物酶基因的扩增与连接．．．．．．．．．．．．．．．．．．70

3.2.3重组表达载体的人源化改造．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．72

3.3单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶重组菌株的筛选与鉴定．．．．75

3.3.1重组菌株的转化与筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．77

3.3.2重组菌株的鉴定与验证．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．80

3.4单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶基因的高效表达条件优化．．83

3.4.1表达条件的影响因素分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．85

3.4.2表达条件的优化策略．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．