蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝染色法.pptVIP

第1页，共20页，星期日，2025年，2月5日一、实验目的了解分光光度技术的一般原理学习722型可见光分光光度计的操作熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法第2页，共20页，星期日，2025年，2月5日二、实验原理分光光度法是一种利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，所使用的仪器称为分光光度计人眼可见的光只占电磁波谱的很小一部分（400~760nm）。它是一种频率较大的电磁波。电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示第3页，共20页，星期日，2025年，2月5日分光光度计的光谱范围：包括波长范围为200～400nm的紫外光区和波长范围为400～760nm的可见光区如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱，不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液，则：入射光=反射光+吸收光+透过光如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素造成的入射光的损失，则：入射光=吸收光+透过光第4页，共20页，星期日，2025年，2月5日朗伯-比尔（Lambert-Beer）光吸收定律设I0为经过空白校正后入射光的强度，It为透过光的强度根据实验得知：It=I0·10－εbc，式中：c表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收物质的光径，用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物质的ε数值不同，所以It/I0=10－εbc令T（透射比）=It/I0，则T=10－εbc，lg（1/T）=εbclg（l/T）为物质的吸光度（A），则A=1g（1/T）＝εbc，此式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律I0IrItIa第5页，共20页，星期日，2025年，2月5日分光光度计的分类无论哪一类分光光度计都包括光源、单色器、吸收池、检测器和显示装置。分光光度计各部件的次序如图所示：红外分光光度计：测定波长范围为大于760nm的红外光区可见光分光光度计：测定波长范围为400～760nm的可见光区紫外分光光度计：测定波长范围为200～400nm的紫外光区0.575光源单色器吸收池检测器显示器第6页，共20页，星期日，2025年，2月5日光源不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源氢灯的发射光谱：氢灯能发出195～400nm波长的光谱，可作为紫外光光度计的光源单色器把混合光波分解为单一波长光的装置在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件棱镜：是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光光栅：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带，对于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱第7页，共20页，星期日，2025年，2月5日吸收池亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）制成在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机玻璃比色杯吸收池使用注意事项吸收池必须与光束方向垂直每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗检测器是一种光电转换装置，主要是把光强度转变成电讯号，再通过放大器把信号输送给测量仪器第8页，共20页，星期日，2025年，2月5日常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管矩阵显示装置把从光电监测器中获得的电信号，通过放大器后，以图形或数字等形式显示出来主要有四种类型：指针式