小鼠P物质(SP)ELISA试剂盒说明书-赛拓森生物.docxVIP

酶联免疫吸附测试EnzymeLinkedImmunosorbentAssay

小鼠P物质(SP)酶联免疫(ELISA)

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用，不得用于临床诊断规格：48T/96T

实验目的：

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中P物质(SP)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠P物质(SP)水平。用纯化的小鼠P物质(SP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P物质(SP)，再与HRP标记的P物质(SP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的P物质(SP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠P物质(SP)浓度。

试剂盒组成：

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1份

1份

封板膜

2片

2片

密封袋

1个

1个

酶标包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

标准品：120ng/L

0.5ml×1瓶

0.5ml×1瓶

2-8℃保存

标准品稀释液

1.5ml×1瓶

1.5ml×1瓶

2-8℃保存

酶标试剂

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

样品稀释液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

显色剂A液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

显色剂B液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

终止液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

浓缩洗涤液

（20ml×20倍）×1瓶

（20ml×30倍）×1瓶

2-8℃保存

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：60、30、15、7.5、3.75ng/L.

样本处理及要求：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量1g，加入9ml的PBS、PH7.4，匀浆的比例1:9，匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）。离心20分钟左右（3000-5000转/分），仔细收集上清。

6.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需自备的仪器耗材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

操作步骤：

1、加样：标准品设定5个浓度点10个孔，每个浓度设定平行孔，加入50μl不同浓度的标准品，空白孔设定1个孔加入50μl蒸馏水（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、温育：操作同2。

7、洗涤：操作同4。

8、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

9、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

10、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，