植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)ELISA试剂盒说明书-赛拓森生物.docxVIP

酶联免疫吸附测试EnzymeLinkedImmunosorbentAssay

植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)酶联免疫(ELISA)

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用，不得用于临床诊断规格：48T/96T

实验目的：

本试剂盒用于测定植物相关样本中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。用纯化的植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)，再与HRP标记的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)浓度。

试剂盒组成：

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1份

1份

封板膜

2片

2片

密封袋

1个

1个

酶标包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

标准品：300ng/L

0.5ml×1瓶

0.5ml×1瓶

2-8℃保存

标准品稀释液

1.5ml×1瓶

1.5ml×1瓶

2-8℃保存

酶标试剂

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

样品稀释液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

显色剂A液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

显色剂B液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

终止液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃保存

浓缩洗涤液

（20ml×20倍）×1瓶

（20ml×30倍）×1瓶

2-8℃保存

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：150、75、37.5、18.75、9.375ng/L.

样本处理及要求：

1、对于样本要求保持鲜重

2、称取样本中的重量不小于50mg，一般以1g为基准,但不严格要求固定样本每个重量必须达到相同的水平。

3、匀浆的比例选取10%，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。

4、匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）

5、匀浆过程选用组织匀浆器，冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检！

需自备的仪器耗材：

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

4.蒸馏水或去离子水

操作步骤：

1、加样：标准品设定5个浓度点10个孔，每个浓度设定平行孔，加入50μl不同浓度的标准品，空白孔设定1个孔加入50μl蒸馏水（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、温育：操作同2。

7、洗涤：操作同4。

8、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

9、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

10、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释

倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释

倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.98以上。

2.批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15%。

检测范围：

4.5ng/L-160ng/L

灵敏度：

最低检测浓度小于1ng/L

保存条件及有效期