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外周血淋巴细胞整合素表达预测子宫内膜容受性研究

一、引言

1.1研究背景

在人类生殖过程中，胚胎着床是成功妊娠的关键步骤，而子宫内膜容受性（EndometrialReceptivity，ER）是决定胚胎能否着床的重要因素。子宫内膜仅在月经周期中的特定时段具备接受胚胎着床的能力，这一时期被称为“着床窗”。若子宫内膜容受性出现异常，将极大地影响胚胎着床，进而导致不孕或反复流产等不良妊娠结局。据相关研究报道，约2/3的胚胎着床失败原因可归咎于子宫内膜容受性受损及其引发的胚胎-子宫内膜相互作用改变。因此，准确评估子宫内膜容受性，对于提高辅助生殖技术的成功率、改善妊娠结局具有至关重要的意义。

细胞黏附分子在胚胎着床过程中发挥着核心作用。其中，整合素（Integrin）作为一组二价阳离子依赖性的跨膜糖蛋白，能够介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的黏附反应。在正常月经周期及妊娠早期，子宫内膜的整合素表达呈现出严格的时间相关性及空间特异性。研究发现，子宫内膜上皮细胞在月经周期的第20-24天会同时表达3种整合素，其表达的特征性变化与滋养细胞侵入时期高度平行。由此推测，整合素αvβ3可能参与了母体与滋养细胞最初接触过程中子宫内膜容受性的建立。故而，整合素已成为评估子宫内膜容受性的关键指标之一。

值得注意的是，近年来有学者发现，不孕症患者子宫内膜中及外周血淋巴细胞表面整合素的表达相较于正常女性显著降低。这一发现提示，外周血淋巴细胞整合素表达或许与子宫内膜容受性之间存在着某种内在联系。鉴于外周血淋巴细胞的检测相较于子宫内膜抽吸或活检，具有操作简便、安全性高的优势（后者常易引发宫内感染或干扰胚胎成功植入），深入探究外周血淋巴细胞整合素表达对子宫内膜容受性的预测价值，具有广阔的临床应用前景。

1.2研究目的

本研究旨在系统探讨体外受精-胚胎移植（InVitroFertilization-EmbryoTransfer，IVF-ET）围着床窗期外周血淋巴细胞整合素β1、β3的表达特征，进而分析其与子宫内膜容受性之间的关联，为临床精准选择胚胎移植时机以及准确判断治疗结局提供坚实可靠的实验依据。

二、材料与方法

2.1研究对象

选取在我院生殖医学中心接受IVF-ET治疗的患者80例，年龄范围为23-35岁，平均年龄（28.5±3.2）岁。所有患者均符合以下纳入标准：①输卵管性不孕或男方因素不孕；②月经周期规律，为28-32天；③子宫内膜厚度在排卵前≥7mm；④血清基础性激素水平正常。排除标准如下：①患有子宫内膜异位症、子宫腺肌病等子宫器质性病变；②存在内分泌系统疾病，如甲状腺功能异常、糖尿病等；③有自身免疫性疾病或免疫功能低下；④近3个月内使用过免疫调节剂或激素类药物。

2.2主要试剂与仪器

实时荧光定量PCR相关试剂购自TaKaRa公司，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBRGreenPCRMasterMix等；流式细胞术检测所需的整合素β1、β3抗体及同型对照抗体均购自BD公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。实时荧光定量PCR仪为ABI7500型，流式细胞仪为BDFACSCalibur型。

2.3实验方法

2.3.1外周血标本采集

分别在hCG注射日、取卵日、移植日、移植后第2、4、6、8天，采集患者外周静脉血5ml，置于含有肝素钠的抗凝管中，轻轻颠倒混匀，避免血液凝固。

2.3.2实时荧光定量PCR检测外周血淋巴细胞整合素β1、β3mRNA表达水平

采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞。具体操作如下：将采集的外周血用PBS按1:1等比例稀释，缓慢加入到含有淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释后的血液与淋巴细胞分离液形成清晰的界面（两者比例为1:1）。室温下，以800g离心力，加速度设为1，减速度设为0，离心30分钟。离心后，可见管内液体分为三层，上层为血浆，中层为淋巴细胞分离液，下层为红细胞，在血浆与淋巴细胞分离液的界面处有一层白色云雾状的白膜层，即为外周血淋巴细胞。小心吸取白膜层细胞至新的离心管中，加入适量PBS，1500转/分钟离心15分钟，弃上清，收集细胞沉淀。按照RNA提取试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度后，依据逆转录试剂盒操作步骤将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应。整合素β1、β3及内参基因GAPDH的引物序列如下：

整合素β