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实验动物学核酸分析操作规程

一、实验动物学核酸分析操作规程概述

本规程旨在规范实验动物学研究中核酸（DNA和RNA）样本的采集、处理、存储、提取和分析操作，确保实验结果的准确性、可靠性和可重复性。操作规程涵盖样本准备、试剂准备、核酸提取、质量检测和实验应用等关键环节，适用于基础医学、生物学及相关领域的科研实验。

二、样本准备与处理

（一）样本采集

1.实验动物选择：根据实验需求选择健康成年实验动物，记录动物编号、品系、性别、年龄及体重等基本信息。

2.采集方法：

(1)外周血：采用毛细血管采血法（如尾静脉）或静脉采血法（如股动脉），采血量根据后续实验需求确定（通常2-5mL）。

(2)组织样本：选择目标组织（如肝脏、脾脏），快速剪取1-2mg样本，立即放入RNAlater溶液或冻存管中保存。

(3)胚胎或细胞样本：根据实验类型选择合适采集方法，如胚胎活检或细胞培养上清液收集。

（二）样本保存与运输

1.保存条件：

(1)血液样本：室温静置30分钟，离心后分离血浆或白细胞层，-80℃冻存。

(2)组织样本：RNA样本需立即浸泡于RNAlater溶液中，-80℃保存；DNA样本可直接冻存。

(3)细胞样本：4℃保存不超过12小时，或-80℃冻存。

2.运输要求：使用保温箱运输，避免反复冻融。

三、试剂与设备准备

（一）试剂配制

1.DNA提取试剂盒：选择商业试剂盒（如QiagenDNeasyBloodTissueKit），按说明书比例配制裂解缓冲液、洗涤缓冲液等。

2.RNA提取试剂盒：选择商业试剂盒（如RNeasyMiniKit），配制RNAlater溶液、DNaseI处理液等。

3.其他试剂：

(1)无核酸酶水（RNase/DNase-freewater）：用于试剂配制和样本处理。

(2)蛋白酶K：用于DNA/RNA样本消化蛋白质（浓度10mg/mL）。

（二）设备校准

1.离心机：转速≥8000×g，平衡校准。

2.分光光度计：检测260/280nm吸光度，校准波长准确度。

3.-80℃冰箱：定期检查温度记录仪，确保稳定在-80℃±5℃。

四、核酸提取操作

（一）DNA提取（以血液样本为例）

1.步骤：

(1)样本解冻：室温融化血液样本，离心5000×g，取白细胞层。

(2)裂解：加入裂解缓冲液（含蛋白酶K），涡旋混匀，55℃水浴1小时。

(3)洗涤：依次加入洗涤缓冲液，离心去除杂质，保留DNA沉淀。

(4)终末洗脱：加入无核酸酶水，65℃洗脱30分钟，收集DNA溶液。

2.质量检测：

(1)吸光值：分光光度计检测260/280nm吸光度比值（1.8-2.0为合格）。

(2)电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带完整性。

（二）RNA提取（以组织样本为例）

1.步骤：

(1)样本前处理：组织样本用液氮研磨成粉末，加入RNAlater溶液（1mL/g组织）。

(2)裂解：加入裂解缓冲液，加入DNaseI处理液（10U/μL），37℃消化30分钟。

(3)提取：同DNA提取的洗涤和洗脱步骤，避免RNase污染。

2.质量检测：

(1)吸光值：260/280nm比值（2.0-2.1为合格）。

(2)电泳检测：NorthernBlot或RIN值检测（推荐RIN7.0）。

五、核酸质量检测与应用

（一）常规检测

1.纯度检测：分光光度计测定吸光值，计算浓度（ng/μL）。

2.完整性检测：

(1)琼脂糖凝胶电泳：观察DNA/RNA条带完整性。

(2)荧光检测：AgilentBioanalyzer检测电泳图谱，计算RIN值。

（二）实验应用

1.PCR检测：

(1)引物设计：根据参考基因组设计特异性引物，退火温度50-65℃。

(2)反应体系：10μLPCR反应液含模板DNA（10-50ng）、引物（10pmol/μL）、Taq酶（1U/μL）。

(3)循环参数：预变性95℃3分钟；变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃60秒，共35个循环。

2.基因测序：

(1)测序平台：选择Illumina或Sanger测序仪，根据片段长度选择建库方法。

(2)数据分析：使用BWA或BLAST软件进行序列比对，Q值＞20为合格。

六、注意事项与废弃物处理

（一）注意事项

1.避免RNase污染：所有操作需在无RNase工作台进行，使用一次性枪头和试剂。

2.样本标识：严格核对样本标签，避免混淆。

3.冻存保护：避免反复冻融，建议分装后冻存。

（二）废弃物处理

1.试剂废弃物：按实验室规定分类处理，含核酸酶K的溶液需高压灭菌后丢弃。

2.生物样本：高压灭菌后按医疗废物处理。

本规程适用于常规实验操作，特殊实