高春生化药物常用分析方法.ppt

双缩脲法是测定蛋白质浓度常用方法之一，它除了操作简便、迅速外，最大的优点是受蛋白质的特异性影响较小，但灵敏度差，所需样品量大。利用铜复合物有紫外吸收的特性，使双缩脲方法能在数十微克水平进行测定。第29页，共81页，星期日，2025年，2月5日3.4.2．试剂碱性铜试剂0.175克硫酸铜溶解于约15毫升水中，置于一100毫升容量瓶中，加入30毫升浓氨水，30毫升冷的蒸馏水及20毫升饱和氢氧化钠溶液，混匀后，放置至使溶液温度与室温相同，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。此试剂在室温下可以放置3-4个月不影响显色。第30页，共81页，星期日，2025年，2月5日3.4.3．操作步骤(1)标准曲线制备每组取7支试管，依次加入蛋白质标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分别补足蒸馏水至3毫升，混匀后各管加2毫升碱性铜试剂，充分混和后，呈现紫色，立即于540nm下测定光吸收（以第一管作空白对照）。(2)供试品测定取3毫升样品溶液，加入碱性铜试剂2毫升，充分混匀后，于540nm下测定吸收值，操作条件同标准曲线。第31页，共81页，星期日，2025年，2月5日3.4.4.注意事项样品溶液与试剂混合后，有时约30分钟后有雾状沉淀产生。这种现象对含脂肪类物质的蛋白质抽提液较易发生，而对于纯蛋白质溶液不明显。克服的方法有三种：（1）加入试剂后立即比色，至少应在30分钟内完成；（2）如沉淀已经产生，则可以放置二小时或更多时间，离心去沉淀后取上清液比色；（3）加1.5毫升乙醇或石油醚，离心后比色。第32页，共81页，星期日，2025年，2月5日3.5紫外吸收法原理蛋白质分子中所含有的酪氨酸和色氨酸残基使蛋白质在280nm下具有最大吸收值；蛋白质溶液在238nm下的光吸收值，其吸收强度与肽键量成正比。利用在一定波长范围内吸收值与蛋白质浓度成正比关系可以进行蛋白质含量的测定。第33页，共81页，星期日，2025年，2月5日4.电泳分析法4.1电泳的基本概念4.2电泳的分类4.3醋酸纤维膜电泳法4.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第34页，共81页，星期日，2025年，2月5日4.1电泳的基本概念电泳：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。第35页，共81页，星期日，2025年，2月5日4.2.电泳的分类按分离原理分类可分为区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4种。（1）区带电泳电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。（2）移界电泳是在U形管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。第36页，共81页，星期日，2025年，2月5日（3）等速电泳需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。（4）等电聚焦电泳由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的pH处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。从表面上看与区带电泳相似，但原理不同。第37页，共81页，星期日，2025年，2月5日4.3.醋酸纤维膜电泳法4.3.1基本概念什么是醋酸纤维膜电泳以醋酸纤维膜为支持介质的一种区带电泳技术。4.3.2原理蛋白质是两性物质，具有两性游离特性。人血白蛋白为一种蛋白质，因而其具有两性化合物的性质，在碱性缓冲液中，即pH质大于等电点时，蛋白质分子带负电荷，在电场中向正极迁移，如果人血白蛋白中含有其他杂蛋白，其带电荷的量会不同于人血白蛋白，在电场中迁移的速度就不同，带负电荷越多的蛋白质其迁移速度越快。这样就会在醋酸纤维薄膜留下不同的区带，经染色后，脱色，扫描后，即可测得人血白蛋白的纯度。第38页，共81页，星期日，2025年，2月5日4.3.3特点：微量，快速，简便，分辨力高，对样品无拖尾及吸附现象等。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生产的醋酸纤维薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致，一般多采用浙江黄岩化工厂生产的醋酸纤维薄膜。第39页，共81页，星期日，2025年，2月5日4.3.4酸纤维薄膜与滤纸比较酸纤维薄膜与滤纸比较有以下优点（1）酸纤维薄膜对蛋白质样品吸收极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量的精确性。（2）快速省时,由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所