DB35-T 916-2009 猪瘟抗体金标试纸检测方法.docxVIP

DB35/T9162009猪瘟抗体金标试纸检测方法

1范围

本标准规定了猪瘟抗体金标试纸检测方法的原理、试剂与材料、仪器设备、样品采集与处理、操作步骤、结果判定和注意事项。

本标准适用于猪血清中猪瘟抗体的快速检测，可用于猪瘟免疫效果评估和疫情监测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T141猪瘟诊断技术

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1猪瘟抗体ClassicalSwineFeverAntibody

猪感染猪瘟病毒或接种猪瘟疫苗后，机体产生的特异性免疫球蛋白。

3.2金标试纸GoldlabeledStrip

以胶体金标记的抗原或抗体为示踪物，通过免疫层析技术检测目标物质的试纸条。

3.3免疫层析Immunochromatography

抗原抗体在层析材料上特异性结合并沿层析方向移动的免疫学检测技术。

4原理

本方法基于免疫层析技术，采用双抗原夹心法检测猪血清中的猪瘟抗体。试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。结合垫上含有胶体金标记的猪瘟病毒抗原，硝酸纤维素膜上包被有猪瘟病毒抗原（检测线）和抗猪IgG抗体（质控线）。

当待检血清样品加入样品垫后，样品中的猪瘟抗体与胶体金标记的猪瘟病毒抗原结合形成复合物，在层析作用下向检测线移动。检测线上的猪瘟病毒抗原与复合物中的猪瘟抗体结合，形成抗原抗体金标抗原夹心复合物，使检测线显色。质控线上的抗猪IgG抗体与未结合的金标抗原结合，使质控线显色，作为试纸条有效的内控标准。

5试剂与材料

5.1试剂盒组成

5.1.1猪瘟抗体金标试纸条：密封包装，每条独立铝箔袋包装，内含干燥剂。

5.1.2样品稀释液：pH7.27.4的磷酸盐缓冲液（PBS），含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%叠氮钠。

5.1.3阳性对照品：猪瘟抗体阳性血清，效价≥1:32。

5.1.4阴性对照品：猪瘟抗体阴性血清，经ELISA和中和试验确认无猪瘟抗体。

5.2试剂要求

5.2.1试纸条应在28°C条件下保存，有效期为12个月。

5.2.2样品稀释液、阳性对照品和阴性对照品应在28°C条件下保存，有效期为6个月。

5.2.3所有试剂应在有效期内使用，使用前应恢复至室温（1825°C）。

5.3其他材料

5.3.1一次性采血管：内径1.52.0mm，长度100mm。

5.3.2离心管：1.5mL和2.0mL。

5.3.3移液器：量程10100μL和1001000μL，精度±5%。

5.3.4计时器：精度±1秒。

5.3.5记录表格：用于记录检测结果。

6仪器设备

6.1台式离心机：转速04000r/min，可调。

6.2恒温水浴箱：温度范围室温100°C，控温精度±0.5°C。

6.3微量移液器：量程10100μL、1001000μL，经计量检定合格。

6.4电子天平：感量0.1g。

6.5生物安全柜：符合GB19489要求。

6.6冰箱：28°C冷藏和20°C冷冻。

7样品采集与处理

7.1样品采集

7.1.1采集猪前腔静脉或耳静脉血液35mL，置于无菌采血管中。

7.1.2采集后的血样应垂直放置，在室温（1825°C）下静置3060min，待血液自然凝固。

7.1.3样品采集后应在24h内处理，如不能及时处理，应置于28°C保存，不超过48h。

7.2样品处理

7.2.1将凝固的血样以3000r/min离心10min，分离血清。

7.2.2用移液器吸取上层血清，转移至洁净离心管中，避免吸入血细胞。

7.2.3血清样品如不能立即检测，应置于20°C冷冻保存，保存期不超过3个月。

7.2.4检测前将冷冻血清样品在室温下自然解冻，充分混匀后使用。

7.2.5血清样品应澄清无溶血，严重溶血的样品应重新采集。

8操作步骤

8.1准备工作

8.1.1从冰箱中取出试剂盒，恢复至室温（1825°C），时间不少于30min。

8.1.2准备好所需的仪器设备，确保处于正常工作状态。

8.1.3检查试纸条包装是否完好，如有破损不得使用。

8.1.4在记录表格上填写样品信息、检测日期和操作人员。

8.2样品稀释

8.2.1取待检血清50μL，加入450μL样品稀释液中，充分混匀，制成1:10稀释样品。

8.2.2阳性对照品和阴性对照品按相同比例稀释。

8.3检测操作

8.3.1从铝箔袋中取出试纸条，平放在洁净干燥的水平面上。

8.3.2用移液器吸取1