DB34-T 1107-2009 豆制品中碱性橙的测定 高效液相色谱法.docxVIP

DB34/T豆制品中碱性橙的测定高效液相色谱法

1范围

本标准规定了豆制品中碱性橙染料的高效液相色谱测定方法。

本标准适用于豆腐、豆腐干、腐竹、豆皮等豆制品中碱性橙的测定。

本标准的方法检出限为0.05mg/kg，定量限为0.15mg/kg。

2原理

试样中的碱性橙经甲醇水溶液提取，固相萃取柱净化，采用高效液相色谱二极管阵列检测器测定，外标法定量。

碱性橙（BasicOrange）是一种偶氮类染料，化学名称为4[(2,4二硝基苯基)偶氮]N,N二甲基苯胺，分子式为C14H12N4O4，相对分子质量为300.27。其结构中含有偶氮基和硝基，在酸性条件下较为稳定，在碱性条件下易分解。该染料在可见光区有特征吸收，最大吸收波长约为450nm。

3试剂和材料

除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

3.1甲醇：色谱纯。

3.2乙腈：色谱纯。

3.3乙酸铵：色谱纯。

3.4甲酸：色谱纯。

3.5碱性橙标准品：纯度≥98%。

3.6甲醇水溶液（7+3，v/v）：量取700mL甲醇，加入300mL水，混匀。

3.70.1%甲酸水溶液：量取1mL甲酸，加入999mL水，混匀。

3.85mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵，溶于1000mL水中，混匀。

3.9碱性橙标准储备溶液（100mg/L）：准确称取10.0mg碱性橙标准品，用甲醇溶解并定容至100mL，摇匀，于4°C避光保存。

3.10碱性橙标准工作溶液：准确吸取适量碱性橙标准储备溶液，用甲醇水溶液（7+3，v/v）逐级稀释成浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L的标准系列工作溶液，临用新配。

4仪器和设备

4.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器（DAD）。

4.2分析天平：感量为0.1mg和0.01g。

4.3均质器：转速不低于10000r/min。

4.4离心机：转速不低于4000r/min。

4.5涡旋混合器。

4.6超声波清洗器。

4.7氮吹仪。

4.8固相萃取装置。

4.9有机相滤膜：0.22μm。

4.10C18固相萃取柱：500mg/6mL，或相当者。

4.11容量瓶：10mL、25mL、50mL、100mL。

4.12具塞离心管：50mL。

4.13移液器：100μL、1000μL、5000μL。

5试样制备与保存

5.1试样制备

取具有代表性的豆制品样品，将其切碎或粉碎，充分混匀。对于含水量较高的样品（如豆腐），应先冷冻后粉碎；对于干燥样品（如腐竹、豆皮），可直接粉碎后过20目筛。

5.2试样保存

6分析步骤

6.1提取

称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL具塞离心管中，加入20mL甲醇水溶液（7+3，v/v），涡旋混合2min，超声提取20min，以4000r/min离心5min。将上清液转移至另一离心管中。残渣重复提取一次，合并上清液，于40°C水浴中氮吹浓缩至近干，用5mL甲醇水溶液（7+3，v/v）溶解残渣，待净化。

6.2净化

将C18固相萃取柱依次用5mL甲醇、5mL水活化。将上述提取液加入固相萃取柱中，控制流速不超过1mL/min。用5mL水淋洗，弃去淋洗液。用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。经0.22μm有机相滤膜过滤，供高效液相色谱测定。

7测定

7.1色谱条件

7.1.1色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者。

7.1.2流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。

7.1.3梯度洗脱程序：0min时，A为80%，B为20%；010min，A线性变化至20%，B线性变化至80%；1015min，保持A为20%，B为80%；1516min，A线性变化至80%，B线性变化至20%；1620min，保持A为80%，B为20%。

7.1.4流速：1.0mL/min。

7.1.5柱温：30°C。

7.1.6进样量：10μL。

7.1.7检测波长：450nm。

7.2标准曲线的绘制

分别吸取6.10中配制的碱性橙标准工作系列溶液各10μL，按7.1规定的色谱条件进行测定，以碱性橙的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

7.3试样测定

吸取6.2中净化后的试样溶液10μL，按7.1规定的色谱条件进行测定，根据保留时间和光谱图定性，峰面积定量。

8结果计算

试样中碱性橙的含量按式（1）计算：

X=(c×V)/m

式中：

X——试样中碱